Advanced medications for delivery of antioxidants and probiotics for tissue repair

Abstract

Il presente lavoro di tesi ha lo scopo di ottimizzare il rilascio di antiossidanti utilizzando un approccio nanotecnologico e di realizzare medicazioni/dispositivi medici per la somministrazione topica di antiossidanti e probiotici. L'alfa-tocoferolo, usato come modello di antiossidante lipofilo, è stato caricato in nanoemulsioni (NE) e stabilizzato con un derivato anfifilico del chitosano (diametro 200-250nm e P.I<0,5) al fine di migliorarne la solubilità e la stabilità ottenendo un’elevata efficienza di incapsulamento: 93,64±7,97%. Il saggio in vitro del DPPH dimostra che tali NE esercitano un’attività di “scavenging” delle specie radicaliche. Le NE, come tali o caricate con l’antiossidante, mostrano capacità di riparazione cellulare in vitro, indipendente dall'antiossidante, su colture di fibroblasti trattati con perossido di idrogeno. Inoltre, le NE stimolano la proliferazione cellulare in colture di cheratinociti e in un modello ex vivo di pelle umane. È stato inoltre utilizzato un modello murino in vivo per verificare la sicurezza e l’attività delle NE nel processo di guarigione. Lo studio di stabilità indica una diminuzione del titolo di antiossidante in NE conservate a 4°C dopo 35 giorni. La stabilità chimica dell'antiossidante è stata migliorata sviluppando una formulazione in polvere mediante un processo di spray-drying ottimizzato con un disegno sperimentale, ottenendo una resa del 40% circa di polvere prodotta e un contenuto residuo di antiossidante tra il 45 e il 90%. La polvere è in grado di cedere oltre il 90% di antiossidante in poche ore, secondo il test di rilascio eseguito mediante celle di Franz. In base ai risultati del saggio del DPPH la polvere mantiene l'attività di “scavenging” delle specie radicaliche. I test di stabilità mostrano che il titolo di antiossidante nella polvere corrisponde a circa il 98% e il 92%, dopo 1 e 3 mesi rispettivamente. Le immagini SEM mostrano la presenza di microparticelle incorporate in una matrice di mannitolo con una forma sferica arrotondata e un diametro sub-micrometrico. Successivamente, il problema pratico dell’applicazione sulle ferite doveva essere risolto. A tal fine, sono state sviluppate diverse formulazioni che possono trovare impiego come medicazioni avanzate. È noto che le medicazioni/film sono particolarmente utili per proteggere le ferite e mantenere le condizioni di umidità ottimali. In particolare, le NE sono state incorporate in film, mentre i probiotici sono stati caricati sia in medicazioni liofilizzate sia in film. In entrambi i casi, sono stati utilizzati come materiali di base diversi polimeri idrofili naturali e sintetici e le loro miscele. I liofilizzati hanno mostrato una buona resistenza meccanica e un'elevata porosità e quindi un'elevata area superficie. La vitalità e la crescita dei probiotici è più elevata nei liofilizzati rispetto ai film e la capacità di idratazione risulta migliore grazie alla loro struttura altamente porosa. Lo studio di stabilità indica che le formulazioni possono essere conservate a 4-8°C per 14 giorni, mantenendo una quantità significativa di probiotici vitali. Gli studi di rilascio effettuati su film caricati con NE suggeriscono che l'antiossidante potrebbe essere rilasciato nella ferita entro un'ora. Le immagini SEM mostrano che sia i liofilizzati sia i film presentano una regolare struttura polimerica. Le immagini CLSM indicano una distribuzione fine e regolare delle NE all'interno della trama polimerica. Entrambe le formulazioni mostrano una buona biocompatibilità in vitro su colture di fibroblasti e proprietà positive di bioadesione, compatibili con un’applicazione topica e mucosale. È stata inoltre realizzata una medicazione complessa, composta dal film compenetrato in un supporto di poliuretano.

The present thesis work was aimed to the optimization of antioxidant delivery to wounds using a nanotechnology approach and to realize medications/medical devices for topical supplementation of antioxidants and probiotics. Alpha-tocopherol, used as model lipophilic antioxidant, was loaded in nanoemulsions (NE) stabilized with hydrophobically modified chitosan with the aim to improve drug solubility and stability (diameter range 200-250nm and P.I.<0.5). The results confirm a high encapsulation efficiency of antioxidant of 93.64±7.97%. In vitro DPPH assay demonstrate an effective radical scavenging activity of NE loaded with antioxidant. NE, both unloaded or loaded with antioxidants, show a reparative actions independently on the presence of the antioxidant on in vitro test on fibroblasts treated with hydrogen peroxide. Furthermore, NE were able to stimulate cell proliferation in human keratinocyte culture and in the ex vivo test on human skin biopsies. Finally, NE were tested on an in vivo murine model to check safety and to obtain a proof of concept of their activity in the healing process. The stability study indicates a decrease in the antioxidant title in samples stored at 4°C after 35 days. The chemical stability of alpha-tocopherol has been improved by developing a solid formulation powder prepared by spray-drying. The preparation process, ameliorated by means of an experimental design, led to a yield of about 40% of recovered powder and to an alpha-tocopherol residual content ranging between 45 and 90%. The release test, using Franz cell method, demonstrate that the powder releases over 90% alpha-tocopherol in few hours. The powder also maintains the radical scavenging activity (tested by DPPH assay). Stability tests show that about 98% and 92% of antioxidant residues after 1 and 3 months, respectively. The S.E.M. microphotographs show the presence of microparticles embedded in a mannitol matrix with a rounded spherical shape and a mean diameter in the micrometer range. The overall results are promising for a possible use of the formulations on wounded skin especially if exacerbated by oxidative stress as in the case of diabetic foot ulcers. Subsequently, the practical problem of topical application to wounds had to be solved. To this purpose, different formulations, to be used as advanced dressings have been developed. It is known that dressings/films are particularly useful to protect and maintain the optimal moisture conditions in wounds. In particular, NE were incorporated in films, whereas probiotics were loaded either in lyophilized dressings or in films. In both cases, well-known natural and synthetic hydrophilic polymers and mixtures thereof were used as base materials. The lyophilized dressings showed good mechanical strength and high porosity and therefore a high surface area. The viability and growth of probiotics in lyophilized dressing was significantly improved with respect to films and the hydration capacity significantly faster due to their highly porous structure. The stability study suggests that formulations can be stored at 4-8°C for 14 days, while maintaining a significant amount of viable probiotics. The release studies effected on films loaded with NE suggest that the antioxidant could be made available to the wound fluids already within one hours. S.E.M. microphotographs show that both films and dressings possess a regular polymeric structure. CLSM microphotographs indicate a fine and regular distribution of NE inside the polymeric network. In vitro evaluation on human fibroblasts indicate a good biocompatibility of the formulations. Both formulations exhibit positive mucoadhesion properties compatible with possible topical application even on wounded mucosa. To realize a composite medication a polymeric backing was used to obtain a film compenetrated in a polyurethanes support.