Discovery, development and pharmacological characterization of small molecules interfering with Eph-ephrin system

Abstract

Eph receptor tyrosine kinases and their membrane-bound ephrin ligands are involved in many biological processes as cell migration and morphology, axon guidance, synaptic plasticity and angiogenesis both during embryogenesis and in adult tissues. Alterations of this system have been found in human cancers and above all, EphA2 and EphB4 overexpression is often correlated with aggressive tumor phenotypes and poor prognosis. Based on this evidence Eph-ephrin system represents a promising target in cancer field. Through an ELISA-based binding screening, we recently identified lithocholic acid (LCA), a secondary bile acid able to modulate Eph-ephrin activity showing a Ki value of 49 µM. LCA resulted a novel specific, reversible, not-selective antagonist of Eph receptors, able to dose-dependently inhibit Eph receptor phosphorylation induced by ephrin ligand in different cell lines and able to inhibit ephrin-A1-induced PC3 cell rounding. Moreover, Surface Plasmon Resonance analysis (SPR) confirmed the specific and reversible binding of LCA to EphA2 receptor, excluding its interaction with ephrin-A1 ligand. Therefore, LCA scaffold was used to design and synthesize a new series of derivatives analyzing the structure-activity relationship and describing the pharmacophoric structure. In particular, we found that the concurrent presence of a large hydrophobic region (cyclopenta[a]perhydrophenantrene scaffold) and an anionic hydrogen bond acceptor group (carboxylate functionality) are essential for the inhibition of EphA2–ephrin-A1 binding. Cholanic acid (Ki = 5.1 µM) and isolithocholic acid (Ki = 25 µM) emerged from this series. Moreover, we observed that the conjugation of the lateral acidic chain with glycine generated a compound (glycolithocholic acid, Ki= 38.5 µM) endowed with an activity similar to LCA. Starting from this discovery, a second series of derivatives, where LCA structure is coupled with amino acids was generated and a new compound emerged: L-Trp LCA (Ki= 1.2 µM), which is structurally formed by LCA structure conjugated with L-Tryptophan. As a result, the most active and promising compounds (cholanic acid, isolithocholic acid and L-Trp-LCA) were further pharmacologically characterized in functional assays. Investigations on PC3, T47D ad HUVE cells revealed that all the compounds able to disrupt EphA2–ephrin-A1 binding in the ELISA assay, were specific, reversible Eph receptors antagonist that dose-dependently inhibited Eph phosphorylation induced by ephrin ligands. Surprisingly, isolithocholic acid showed similar potency values in EphA2 antagonism compared to cholanic acid and L-Trp LCA, due to its activity on EphA2 kinase that is not shared by the other derivatives. Compounds were also able to inhibit PC3 cell rounding and retraction induced by ephrin-A1 ligand, and L-Trp LCA was particularly active in blocking these cell morphology changes. Moreover, through the tube formation assay performed in HUVECs, the antiangiogenic properties of the compounds have been evaluated. Among the active compounds, cholanic acid resulted the most potent in the inhibition of vessels reticulation, at not-cytotoxic concentrations. Beside LCA, in our ELISA binding based screening we identified also nine plant extracts, rich of polyphenols, commonly used as food supplements. In displacement studies they were able to reversibly inhibit EphA2–ephrin-A1 binding showing IC50 values between 0.83-24 µg/ml. The active extracts were further characterized and showed also specific antagonistic properties toward EphA2 receptor.

All together, these findings could be useful to better characterize the Eph-ephrin system in its complexity as well as to figure out the role played by this system in physiological and pathological conditions. Finally, the identification of a pharmacophoric scaffold could be an interesting starting point for a rational chemical synthesis of new compounds with better affinity and improved physicochemical properties.

I recettori tirosina kinasi Eph e i rispettivi ligandi, le efrine, sono entrambi localizzati sulla membrana plasmatica e sono coinvolti in diversi processi biologici sia durante lo sviluppo embrionale, sia nella vita adulta. Tali processi comprendono: migrazione e variazioni della morfologia cellulare, guida assonale, plasticità sinaptica e angiogenesi. Alterazioni di questo sistema sono state individuate in diverse tipologie di tumore nell’uomo e soprattutto la sovraespressione dei recettori EphA2 ed EphB4 è stata sempre più spesso associata a fenotipi tumorali maggiormente aggressivi e ad una prognosi infausta. Tali evidenze hanno messo in luce il sistema Eph-ephrin come target promettente in campo oncologico. Attraverso uno screening basato su un sistema di saggi di legame ELISA, abbiamo recentemente individuato l’acido litocolico (LCA), un acido biliare secondario in grado di interferire con il sistema Eph-ephrin evidenziando un valore di Ki pari a 49 µM. LCA si è dimostrato un antagonista specifico, reversibile e non selettivo dei recettori Eph, in grado di inibire in maniera dose-dipendente la fosforilazione dei recettori Eph indotta dai rispettivi ligandi in differenti linee cellulari ed in grado anche di inibire l’arrotondamento delle cellule PC3 stimolate dal ligando ephrin-A1. Oltretutto, l’analisi condotta con la Plasmon Resonance (SPR) ha confermato che LCA si lega in maniera specifica e reversibile ad EphA2 escludendo interazioni con il ligando ephrin-A1. Di conseguenza, la struttura dell’acido litocolico è stata utilizzata come modello per lo sviluppo e la sintesi di una nuova serie di derivati di cui è stata analizzata la relazione struttura- attività ed è stato ricavato il gruppo farmacoforico. In particolare, di questa serie abbiamo osservato che la presenza contemporanea di una grande regione idrofobica (la struttura ciclopenta[a]peridrodrofenantrenica) e di un gruppo anionico accettore di elettroni (funzione carbossilica) sono essenziali per l’attività inibitoria del legame EphA2–ephrin-A1. Due composti sono emersi da questa prima serie: l’acido colanico (Ki= 5.1 µM) e l’acido isolitocolico (Ki= 25 µM). Inoltre, abbiamo osservato che la coniugazione della catena acida laterale con una glicina è in grado di generare un composto (acido glicolitocolico , Ki=38.5 µM) che presenta attività simile all’acido litocolico. Partendo da questo dato, è stata prodotta una seconda serie di derivati, in cui la struttura di LCA è accoppiata ad aminoacidi. Tra questi è emerso un nuovo composto, L-Trp LCA (Ki= 1.2 µM), in cui la struttura di LCA è stata derivatizzata con un L-Triptofano. A questo punto, i composti più attivi e promettenti (acido colanico, acido isolitocolico e L-Trp LCA) sono stati farmacologicamente caratterizzati in saggi funzionali. Esperimenti effettuati su PC3, T47D e HUVEC hanno rivelato che tutti i composti che sono stati in grado di inibire il legame EphA2–ephrin-A1 nei saggi ELISA,sono degli antagonisti specifici, reversibili per i recettori Eph che inibiscono in maniera dose-dipendente la fosforilazione dei recettori Eph indotta dai ligandi efrina. Sorprendentemente, l’acido isolitocolico ha mostrato valori di potenza comparabili a LCA e L-Trp LCA nell’antagonismo sul recettore EphA2, e ciò è dovuto alla sua attività anche a livello kinasico, non mostrata invece dagli altri composti. Infine, i derivati sono stati in grado di inibire l’arrotondamento e la retrazione indotta da ephrin-A1 delle cellule PC3 e L-Trp LCA si è mostrato particolarmente attivo nel bloccare tali cambiamenti morfologici delle cellule. Attraverso il tube formation assay effettuato in HUVEC, sono state valutate anche le proprietà antiangiogeniche dei composti attivi. Fra quelli considerati, l’acido colanico si è dimostrato il più potente nel bloccare la formazione dei vasi, a concentrazioni non tossiche. Accanto ad LCA, nel nostro screening iniziale abbiamo identificato anche nove estratti naturali derivati da piante, ricchi di polifenoli, usati comunemente come supplementi nella dieta. In studi di spiazzamento sono stati in grado di inibire reversibilmente il legame EphA2–ephrin-A1, mostrando valori di IC50 compresi tra 0.83-24 µg/ml. Gli estratti attivi sono stati dunque caratterizzati in dettaglio e si sono rivelati specifici antagonisti per il recettore EphA2.

Nel loro insieme, le valutazioni qui elencate, possono essere utili non solo per caratterizzare il sistema Eph-ephrin nella sua complessità ma anche per comprendere al meglio il ruolo giocato dal sistema in condizioni fisiologiche e patologiche. Infine, l’identificazione del gruppo farmacoforico può essere considerato un importante punto di partenza per una sintesi chimica razionale dei nuovi composti con valori di affinità migliorati e caratteristiche chimico-fisiche più maneggevoli.