Isolamento di cellule stromali mesenchimali da tessuto adiposo di tartaruga Trachemys Scripta

Abstract

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono da anni oggetto di studio in campo della medicina rigenerativa umana e veterinaria. Sempre più spesso sono sfruttate le capacità terapeutiche di queste cellule per curare diverse patologie degli animali da compagnia e del cavallo. In letteratura, tuttavia, non sono presenti molti studi sull’isolamento e lo studio in vitro di cellule derivate dai rettili. I riferimenti si limitano a pochi studi relativi all’isolamento di fibroblasti da cheloni. Per quanto riguarda in modo specifico le MSC, è riportato soltanto l’isolamento di MSC in una specie di anfibio (Xenopus laevis). In questo studio sono state isolate e parzialmente caratterizzate MSC a partire da tessuto adiposo di Trachemys scripta ottenuto dalla fossa prefermorale durante la procedura chirurgica di sterilizzazione. Questa specie è stata scelta come modello per lo studio in quanto in Italia è presente il “Piano nazionale per la gestione della testuggine palustre americana (Trachemys scripta)” che prevede la sterilizzazione chirurgica dei soggetti per il controllo della popolazione invasiva. Durante la procedura di sterilizzazione è stato quindi possibile ottenere il campione di tessuto adiposo dall’animale senza ulteriori sofferenze. Pur non avendo T. scripta un interesse clinico specifico, la disponibilità dei campioni di tessuto adiposo ha reso questa specie un modello ideale per questo studio. Basandosi sulla scarsa letteratura pubblicata circa le colture cellulari di chelone e le MSC di X. laevis e mammifero, si sono scelte le seguenti condizioni di coltura: DMEM come medium di coltura, 28°C e 5% di CO2 come parametri ambientali delle colture. In queste condizioni di coltura è stato possibile isolare cellule con morfologia simile ai fibroblasti sia partendo dalla digestione enzimatica del tessuto adiposo che da frammenti ottenuti meccanicamente dal tessuto. Le metodiche di tripsinizzazione, amplificazione cellulare, crioconservazione e conta dei CFU sono le medesime di quelle utilizzate in ambito di MSC di mammifero e si sono rivelate efficaci anche con le cellule di T.scripta. Per la caratterizzazione cellulare sono stati seguiti sostanzialmente i criteri pubblicati dall’ISTC (International Society for Cellular Therapy). Le curve cellulari hanno indicato che le MSC di T.scripta mantengono costante la capacità replicativa dal P1 al P8 e che presentano, in media, una capacità di replicazione più bassa rispetto a MSC di altre specie di mammifero, ma anche di X. Laevis. Le cellule stimolate con i medium di differenziazione utilizzati tipicamente per le MSC di mammifero sono state in grado di differenziare in senso adipocitico, condrogenico e osteogenico. La fenotipizzazione delle cellule è stata fatta mediante studio dell’espressione genica in RT-PCR in quanto non sono presenti al momento anticorpi per la citofluorimetria (tecnica gold standard) utilizzabili per caratterizzare cellule di T.scripta. I primer per la ricerca dei geni sono stati progettati appositamente partendo dalle sequenze presenti nel genoma della specie di interesse in NCBI in quanto non presenti in letteratura. L’espressione dei geni è stata valutata sia sulle MSC che sui leucociti di T.scripta, utilizzati come controllo negativo o positivo in funzione del marker analizzato. Le cellule esprimono CD 105, CD 73, CD 44, CD 90 e GAPDH, non esprimono CD 34 e HLADRA. La ricerca dell’espressione di CD 45 e CD 31 non ha portato risultati soddisfacenti in nessun tipo cellulare. Tutti i geni ottenuti tramite PCR sono stati sequenziati, ed il confronto delle sequenze ottenute con le sequenze presenti sul sito ha riscontrato un’omologia > del 98%. Dati i risultati ottenuti si può affermare che le cellule isolate si possano identificare con grande probabilità come MSC derivate da tessuto adiposo di T. Scripta, ulteriori studi sono necessari prima di poter valutarne l’utilizzo in medicina rigenerativa

Mesenchymal stromal cells (MSCs) have been studied for years in the fields of human and veterinary regenerative medicine. The therapeutic feature of these cells are being exploited more and more in recent years to treat various diseases in companion animals and horses. In the literature, however, there are not many studies on the isolation and in vitro study of reptile-derived cells. References are limited to a few studies related to the isolation of fibroblasts from chelonium. Regarding MSCs specifically, only the isolation of MSCs in an amphibian species (Xenopus laevis) is reported. In this study, MSCs were isolated and partially characterized from adipose tissue of Trachemys scripta obtained from the prefermoral fossa during the surgical sterilization procedure. This species was chosen as the model for the study because Italy has a "National Plan for the Management of the American Marsh Tortoise (Trachemys scripta)," which requires surgical sterilization of individuals to control the invasive population. Therefore, during the sterilization procedure, it was possible to obtain the adipose tissue sample from the animal without further suffering. Although T. scripta has no specific clinical interest, the availability of the adipose tissue samples made this species an ideal model for this study. The following culture conditions were chosen based on the small published literature about chelonian cell cultures and MSCs of X.laevis and mammalian: DMEM as culture medium, 28°C and 5% CO2 as culture environmental parameters, it was possible to isolate cells with fibroblast-like morphology either from enzymatic digestion of adipose tissue or from fragments obtained mechanically from the tissue under these culture conditions. The methods of trypsinization, cell amplification, cryopreservation, and CFU counts are the same as those used in mammalian MSCs and have also proved effective with T.scripta cells. The criteria published by the International Society for Cellular Therapy (ISTC) were basically followed for cell characterization. The cell curves indicated that MSCs of T.scripta maintain constant replicative capacity from P1 to P8 and that they exhibit, on average, lower replication capacity than MSCs of other mammalian species as well as X. Laevis. Cells stimulated with differentiation medium typically used for mammalian MSCs were able to differentiate in an adipocytic, chondrogenic, and osteogenic direction. Phenotyping of the cells was done by gene expression study in RT-PCR as there are currently no antibodies for cytofluorimetry (gold standard technique) that can be used to characterize T.scripta cells. Primers to search for genes were specially designed from the present sequences of the genome of the species of interest in NCBI as they are not present in the literature. Gene expression was assessed on both MSCs and T.scripta leukocytes, which were used as negative or positive controls depending on the marker analyzed. The cells expressed CD 105, CD 73, CD 44, CD 90 and GAPDH; they did not express CD 34 and HLADRA. Searching for the expression of CD 45 and CD 31 did not yield satisfactory results in any cell type. All genes obtained by PCR were sequenced, and comparison of the sequences obtained with sequences present at the site found >98% homology. Given the results obtained, it can be stated that the isolated cells can be identified with high probability as MSCs derived from T. scripta adipose tissue; further studies are needed before their use in regenerative medicine can be evaluated