Particle engineering applied for development of dry powders for inhalation containing biotechnological drugs

Abstract

Lo scopo di questo lavoro è stato la formulazione di polveri per inalazione prodotte mediante spray drying, contenenti peptidi terapeutici. Nella prima parte del lavoro è stata prodotta una polvere per inalazione di ciclosporina, un peptide ciclico immunosoppressivo, per la prevenzione del rigetto polmonare dopo il trapianto e per il trattamento del Covid-19. L'ottimizzazione della formulazione e l'effetto degli eccipienti utilizzati (mannitolo, glicina ed etanolo) sono stati effettuati utilizzando un disegno sperimentale. La polvere contenente il 20% p/p di mannitolo e il 45% v/v di etanolo nella soluzione della materia prima, ha dimostrato un migliore profilo di dissoluzione (tempo medio di dissoluzione di 59,5 ± 2,3 min rispetto alla ciclosporina grezza 169,02 ± 29,69 min). Inoltre, questa polvere ha presentato un diametro aerodinamico mediano di massa di 2,97 ± 0,1 µm e una frazione di particelle fini di 66,5 ± 2,6%. La polvere ha anche portato alla riduzione della produzione di IL-6 nella co-coltura di A549 (linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano) e THP-1 (linea cellulare monocitica di leucemia umana). È stata inoltre dimostrata l'efficacia di questa formulazione nel ridurre l'infezione da SARS-CoV-2 su cellule Vero E6 (linea cellulare renale di scimmia verde Africana). Nella seconda parte di questo lavoro, la ciclosporina è stata caricata in liposomi di circa 43 nm di lecitina successivamente rivestiti con fosfato di calcio, questo rivestimento è stato aggiunto con l'obiettivo di migliorare l'assorbimento cellulare e la riduzione della dose di ciclosporina. La presenza di fosfato di calcio è stata verificata mediante titolazione del calcio, misurazione del potenziale Z e osservazione diretta mediante Cryo-TEM. La formulazione liquida è stata quindi trasformata in polvere per inalazione mediante spray drying e utilizzando un rapporto tra mannitolo e contenuto solido della dispersione liposomiale di 1:3 per formare le microparticelle. L'aggiunta di leucina al 15% p/p sul contenuto di mannitolo ha inoltre dimostrato un miglioramento delle prestazioni aerodinamiche della polvere. I liposomi rivestiti hanno mostrato una maggiore capacità antinfiammatoria rispetto alla formulazione contenente liposomi non rivestiti con fosfato di calcio e anche rispetto alla ciclosporina non formulata. Nell'ultima parte di questo lavoro, la pramlintide, un peptide ciclico coinvolto nell'omeostasi del glucosio capace anche di rallentare lo svuotamento gastrico e aumentare il senso di sazietà, è stato formulato come polvere secca utilizzando trealosio diidrato, raffinosio pentaidrato e sodio ialuronato a due differenti pesi molecolari (92 e 804kDa), con l’obiettivo per studiare la capacità dei diversi eccipienti di portare alla formazione di particelle inalabili mediante spray drying e di stabilizzare il peptide nella formulazione allo stato solido, inoltre è stato effettuato lo studio dello stato solido delle formulazioni ottenute e dei materiali di partenza mediante diffrattometria a raggi X, calorimetria differenziale a scansione e analisi termogravimetrica. È stato possibile stabilizzare il peptide come polvere secca utilizzando trealosio e sodio ialuronato (92kDa) con una quantità di pramlintide stabile rispettivamente del 97,5% e dell'82,6% rispetto al titolo iniziale di pramlintide.

The aim of this work was the formulation of inhalation powders produced by spray drying, containing therapeutic peptides. In the first part of the work, it was produced an inhalation powder of cyclosporine, an immunosuppressive cyclic peptide, for the prevention of lung rejection after transplantation and for the treatment of Covid-19. The optimisation of the formulation and the effect of the excipients used (mannitol, glycine, and ethanol) were carried out using a design of experiment. The powder containing 20% w/w mannitol and 45% v/v ethanol in the feedstock solution demonstrated a better dissolution profile (mean dissolution time of 59.5 ± 2.3 min than the raw cyclosporine 169.02 ± 29.69 min). Moreover, this powder presented a mass median aerodynamic diameter of 2.97 ± 0.1 µm and a fine particle fraction of 66.5 ± 2.6%. The powder also led to the reduction of IL-6 production in the co-culture of A549 (human lung adenocarcinoma cell line) and THP-1 (human leukaemia monocytic cell line). The efficacy of this formulation in reducing SARS-CoV-2 infection on Vero E6 cells (African green monkey kidney Cell Line) was also demonstrated. In the second part of this work, cyclosporine was loaded into liposomes of about 43 nm and subsequently coated with calcium phosphate, with the aim of improving cell uptake and the reduction of the dose. The presence of calcium phosphate was verified by calcium titration, measurement of Z-potential and direct observation by Cryo-TEM. The liquid formulation was then transformed into inhalation powder by spray drying and using a ratio between mannitol and liposomal dispersion solid content of 1:3 to form the microparticles. The addition of leucine at 15% w/w on the mannitol content has also demonstrated an improvement in the aerodynamic performance of the powder. The coated liposomes showed an increased anti-inflammatory capacity compared to the formulation containing uncoated liposomes with calcium phosphate and raw cyclosporine. In the last part of this work, pramlintide, a cyclic peptide involved in glucose homeostasis also capable of slowing gastric emptying and increasing the sense of satiety. This peptide was formulated as a dry powder using trehalose dihydrate, raffinose pentahydrate and sodium hyaluronate with two different molecular weights (92 and 804kDa). The effect of the different excipients to form inhalable particles and stabilising the peptide in the solid state formulation was evaluated. Furthermore, the solid-state study of the formulations and the raw materials was carried out by X-ray powder diffraction, differential scanning calorimetry and thermogravimetric analysis. Finally, It was possible to stabilise the peptide as a dry powder using trehalose and sodium hyaluronate 92kDa with an amount of stabile pramlintide of 97.5% and 82.6% respectively compared to the initial amount of pramlintide.