Biosintesi dell’acido δ1-pirrolin-5-carbossilico e sua riduzione a prolina: meccanismi di regolazione in specie vegetali modello e in altri eucarioti, e possibili applicazioni

Abstract

Stress is a factor that can negatively affect plants’ functions, altering their growth and productivity. Due to their sessile nature, plants are unable to escape this situation. For this reason, evolution has led to the development of some defense mechanisms to limit the damage caused by biotic and abiotic stress conditions. Among these strategies, many plants accumulate in the cell high concentrations of the so-called compatible osmolytes, such as proline, a very soluble imino acid involved in protein synthesis. Proline metabolism is a conserved process within almost all organisms, both prokaryotes and eukaryotes, which uses glutamate or ornithine as precursors. In most higher eukaryotes, biosynthesis proceeds mainly from glutamate that is reduced in the cytosol to pyrroline-5- carboxylate (P5C) by P5C synthetase (P5CS); P5C is then reduced in turn to proline by P5C reductase (P5CR). The catabolic process takes place in the mitochondrion by the action, in order, of proline dehydrogenase (PRODH) and P5C dehydrogenase (P5CDH), which oxidize proline to P5C and P5C to glutamate. Proline metabolism enzymes use a series of cofactors such as NAD(P)+, NAD(P)H and FAD needed to provide or acquire electrons during redox reactions. It is therefore easy to understand how these processes can reflect on the redox balance and the energy state of the cells. Furthermore, in animals and very probably also in plants, a cycle is established between mitochondria and cytosol in which PRODH and P5CR catalyse the interconversion of proline to P5C. This apparently futile cycle allows for the regulation of the levels of pyridine nucleotides, the synthesis of ATP, the production of ROS, and the exchange of reducing equivalents between the two compartments, resulting very advantageous for the cellular economy. The experiments performed in the frame of this Ph.D. project were carried out on both plant and animal model systems. To better understand the functions and implications of proline, in fact, it is important to compare different systems, identifying all possible similarities and differences. For example, yeast represents an exception compared to most other organisms since it does not accumulate proline following the exposure to stress and, to date, there is no evidence related to the existence of the proline-P5C cycle in this species. Therefore, the biochemical characterization of the P5CR of Saccharomyces cerevisiae was performed, with particular attention to its post-translational regulation. The analysis highlighted the fact that the enzyme seems to prefer the use of NADH as the electron donor, unlike the P5CR from Arabidopsis thaliana (A. thaliana) and rice, and that in the presence of millimolar concentrations of exogenous proline, the catalytic activity is inhibited. Furthermore, the lack of stimulation by salts is consistent with the fact that osmotic stress does not induce proline accumulation in yeast. Further aspects have been investigated for human P5CR. In this case, in addition to the biochemical characterization, the ability of molecules of phosphonic nature to inhibit the enzyme was evaluated. These substances had already been tested and proved to be active against plant and bacterial P5CRs. The decision to extend the investigation to the human enzyme derives from the fact that in many types of cancers, there is an increase in the expression of P5CR, which leads to an increase in the activity of the cycle between proline and P5C, favoring the development of neoplasia. Therefore, through this inhibitory strategy, it was possible to observe the repercussions resulting from the interference with the cycle and the importance that the latter covers. Testing the inhibitor on some human tumor cell lines showed in fact a reduction in cell proliferation and viability. In the synthesis of proline from glutamate, the limiting step is the one catalyzed by the P5CS enzyme. In many higher plant species, including A. thaliana and Oryza sativa (O. sativa), the gene coding for this enzyme has undergone a duplication process, giving rise to the isoenzymes P5CS1 and P5CS2. To date, the studies carried out to understand the differences between them have mainly focused on the analysis of their transcriptional regulation. However, the biochemical characteristics of these two isoforms should also be investigated, therefore in this project the enzymes P5CS1 of A. thaliana and P5CS2 of rice were cloned, expressed in bacterial cells and characterized. Through enzymatic assays conducted in vitro, it was possible to determine the kinetic properties of both enzymes and the mechanisms for their post-translational regulation. Investigations on the second isoform of rice were completed, highlighting that exogenous proline, even at low concentrations, inhibits the enzyme, while the presence of chlorides has a positive effect on the activity. It has been hypothesized that both rice isoenzymes are involved in the accumulation of proline during osmotic stress, while in A. thaliana they should play a more distinct functional role. For this reason, it was decided to continue the experiments on AtP5CS1 and AtP5CS2 enzymes. In the present project some preliminary results related to AtP5CS1 are reported that show some relevant details. Also this isoform, as expected, is positively modulated by the presence of salts. More interestingly, proline does not exert feedback inhibition, supporting the hypothesis that this isoenzyme allows the plant to accumulate the amino acid during exposure to osmotic stress. The last aspect taken into consideration concerns the role of proline within the symbiotic process between legumes and rhizobia. Some studies reported that the levels of some enzymes involved in proline metabolism increase inside the nodules during symbiosis. To explain this phenomenon, some hypotheses have been formulated on the implications that proline can have in the process, during which it could act as an energy substrate, support symbiosis in stressful situations, or play a role in the differentiation of bacteroids. None of these theories has been conclusively proven, but understanding these mechanisms could prove fundamental to maximize the yields obtainable from the symbiotic process. For this reason, information relating to the topic was collected and presented in a mini-review, where informations relating to a third isoform of P5CS identified in Medicago truncatula were also reported, which could represent a specific leguminous variant involved in the symbiotic process. Within this doctoral project, therefore, some research lines have been carried out to broaden our knowledge relating to the roles of proline and the regulation of the enzymes involved in its metabolism, with the aim to provide new ideas toward the development of new plant varieties more able to cope with stressful situations.

Lo stress è un fattore che può influire negativamente sulle funzioni delle piante, alterandone crescita e produttività. A causa della loro natura sessile, i vegetali non sono in grado di sfuggire a tale situazione. Per questo l'evoluzione ha condotto verso lo sviluppo di alcuni meccanismi di difesa al fine di limitare i danni causati da stress biotici e abiotici. Tra queste strategie, molte piante accumulano osmoliti compatibili all'interno delle loro cellule, come ad esempio la prolina, un iminoacido molto solubile implicato nella sintesi proteica. Il metabolismo della prolina è un processo piuttosto conservato all’interno di quasi tutti gli organismi, sia procarioti che eucarioti, e utilizza come precursori glutammato o ornitina. Nella maggior parte degli eucarioti superiori la principale via è quella del glutammato che viene ridotto nel citosol prima a pirrolin-5-carbossilato (P5C) e poi a prolina dagli enzimi P5C sintetasi (P5CS) e P5C reduttasi (P5 ). l processo catabolico si compie invece nei mitocondri e consiste nell’azione, in sequenza, di prolina deidrogenasi (PRODH) e di P5C deidrogenasi (P5CDH), le quali ossidano la prolina a P5C ed il P5C a glutammato. Gli enzimi del metabolismo della prolina utilizzano una serie di cofattori quali NAD(P)+, NAD(P)H e FAD necessari per cedere o acquisire gli elettroni durante le reazioni di ossidoriduzione. È quindi facile intuire come questi processi possano avere importanti ripercussioni sull’equilibrio redox e sullo stato energetico delle cellule. Inoltre, negli animali e con grande probabilità anche nei vegetali si instaura un ciclo tra mitocondri e citosol in cui partecipano PRODH e P5CR per convertire la prolina a P5C e viceversa. Questo ciclo apparentemente futile in realtà permette di regolare i livelli di nucleotidi piridinici, la sintesi di ATP, la produzione di ROS e lo scambio di equivalenti riducenti tra i due compartimenti, risultando molto vantaggioso per l’economia cellulare. Gli esperimenti condotti nell’ambito di questo progetto di dottorato sono stati eseguiti su sistemi modello, sia vegetali che animali. Per meglio comprendere funzioni ed implicazioni della prolina, infatti, è importante mettere a confronto tra loro sistemi differenti individuandone tutte le eventuali analogie e differenze. Per esempio, il lievito rappresenta un’eccezione rispetto alla maggior parte degli organismi poiché non accumula prolina in seguito a situazioni di stress e, ad oggi, non sono riportate evidenze relative all’esistenza del ciclo prolina-P5C in questo organismo. È stata pertanto effettuata la caratterizzazione biochimica della P5CR di S. cerevisiae, con particolare attenzione verso la sua regolazione post-traduzionale. Le analisi hanno messo in evidenza il fatto che l’enzima sembri prediligere l’utilizzo di NADH come donatore di elettroni, a differenza della P5CR di Arabidopsis e riso, e che in presenza di concentrazioni millimolari di prolina l’attività catalitica risulta inibita. Inoltre, la mancata stimolazione da parte dei sali concorda con il fatto che in lievito lo stress osmotico non induce l’accumulo di prolina. Ulteriori aspetti sono stati indagati per la P5CR umana. In questo caso, oltre alla caratterizzazione biochimica, si è infatti valutata la capacità di molecole di natura fosfonica di inibire l’enzima. ali sostanze erano già state testate risultando attive nei confronti delle P5CR vegetale e batterica. La scelta di estendere l’indagine all’enzima umano deriva dal fatto che in molti tipi di tumore si riscontra un incremento nell’espressione della P5 , che comporta un aumento di attività del ciclo P5C-prolina, favorendo lo sviluppo delle neoplasie. Quindi, attraverso questa strategia inibitoria, è stato possibile osservare le ripercussioni conseguenti all’interferenza con il ciclo e l’importanza che quest’ultimo ricopre. estando l’inibitore su alcune linee tumorali umane è stata infatti riscontrata una riduzione della proliferazione e della vitalità cellulare. Per la sintesi di prolina a partire da glutammato, lo step anabolico limitante è quello catalizzato dall’enzima P5 . n molte specie vegetali superiori, tra cui Arabidopsis thaliana e Oryza sativa, il gene codificante per questo enzima ha subito un processo di duplicazione, dando origine agli isoenzimi P5CS1 e P5CS2. Fino ad oggi gli studi in cui si cerca di comprendere quali siano le differenze tra i due si sono principalmente soffermati sull’analisi della loro regolazione trascrizionale. È però opportuno indagare anche le caratteristiche biochimiche di queste due isoforme, perciò nel corso di questo progetto gli enzimi P5CS1 di Arabidopsis thaliana (At) e P5CS2 di riso sono stati clonati, espressi in cellule batteriche e caratterizzati. Attraverso saggi enzimatici condotti in vitro è stato possibile determinare le proprietà cinetiche di entrambi gli enzimi, e la loro regolazione post- traduzionale. Le indagini sulla seconda isoforma di riso sono state portate a termine evidenziando che la prolina esogena, anche a basse concentrazioni, inibisce l’enzima, mentre la presenza di cloruri manifesta un effetto positivo sull’attività. i ipotizza infatti che entrambi gli isoenzimi di riso siano coinvolti nell’accumulo di prolina durante lo stress osmotico, mentre in Arabidopsis la distinzione funzionale dovrebbe essere più netta. Per questo motivo si è deciso di proseguire gli esperimenti sugli enzimi AtP5CS1 e AtP5CS2. I risultati relativi ad AtP5CS1, pur ancora preliminari, mostrano alcuni particolari rilevanti. Anche questa isoforma, come atteso, viene positivamente modulata dalla presenza di sali. Quel che suscita maggiore interesse però consiste nel fatto che la prolina non esercita inibizione a feed-back, supportando l’ipotesi secondo cui questo isoenzima permetta alla pianta di continuare ad accumulare l’aminoacido durante l’esposizione a stress osmotico. ’ultimo aspetto preso in considerazione riguarda il ruolo della prolina all’interno del processo simbiontico tra leguminose e rizobi. In alcuni casi, infatti, è stato riportato che i livelli di alcuni enzimi coinvolti nel metabolismo della prolina aumentano all’interno dei noduli durante la simbiosi. on l’intento di fornire una spiegazione a questo fenomeno sono state formulate alcune ipotesi sulle implicazioni che la prolina può avere nel processo, durante il quale potrebbe per esempio fungere da substrato energetico, supportare la simbiosi in situazioni di stress o giocare un ruolo nel differenziamento dei batteroidi. Nessuna di queste teorie è stata provata in maniera definitiva, ma la comprensione di questi meccanismi potrebbe rivelarsi fondamentale per massimizzare le rese ottenibili dal processo simbiontico. Per questo motivo le informazioni riguardanti l’argomento sono state raccolte e rielaborate all’interno di una mini-review, dove sono state trattate anche le informazioni relative ad una terza isoforma di P5CS identificata in Medicago truncatula, la quale potrebbe rappresentare una variante leguminosa-specifica implicata nel processo simbiontico. ell’ambito di questo progetto di dottorato, dunque, sono state portate avanti alcune linee di ricerca al fine di ampliare le conoscenze relative ai ruoli della prolina ed alla regolazione degli enzimi coinvolti nel suo metabolismo, con l’ambizione di fornire spunti per l’elaborazione di nuove strategie utili ad ottenere varietà di piante più capaci di fronteggiare le situazioni di stress.