Up-regolazione di CD38 e deplezione di NAD nella disfunzione T linfocitaria in corso di epatite cronica B

Abstract

Si stima che nel mondo più di 257 milioni di persone abbiano contratto un’infezione cronica da HBV. Attualmente il trattamento dell’epatite cronica B è principalmente basato sulla terapia con analoghi nucleos(t)idici (NUC), che nella maggior parte dei pazienti deve tuttavia essere somministrata per tutta la vita per il rischio di pericolose riattivazioni virali alla sospensione del trattamento. Esiste pertanto un’urgente necessità di approcci terapeutici che accelerino il controllo virale completo, al fine di abbreviare la durata delle attuali terapie. In corso di infezione cronica i linfociti T HBV-specifici risultano profondamente disfunzionali, e perdono progressivamente le loro funzioni in un processo noto come “exhaustion linfocitaria”. Pertanto, la ricostituzione di una risposta anti-virale efficiente rappresenta una strategia razionale per il trattamento dei pazienti con infezione cronica da HBV e per l’integrazione delle attuali terapie anti-virali. Nel Laboratorio di Immunopatologia Virale dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma è stato precedentemente condotto uno studio di trascrittomica, allo scopo di individuare direttamente nei linfociti T CD8 HBV-specifici isolati da pazienti con infezione cronica le alterazioni funzionali associate alla persistenza virale. Tale studio ha permesso di evidenziare una prevalente down-regolazione di geni coinvolti in diverse funzioni cellulari; particolarmente significative sono quelle relative a vari processi mitocondriali, al sistema ubiquitina-proteasoma, alla risposta al danno del DNA e al controllo epigenetico della trascrizione. La disfunzione mitocondriale, con eccesso di produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), e l’alterazione della proteostasi cellulare sono state successivamente validate tramite test funzionali. È emerso inoltre che i linfociti HBV-specifici mostrano un accumulo di danno al DNA e un’inefficiente risposta al danno, una diminuita acetilazione istonica e telomeri significativamente più corti rispetto a linfociti funzionali influenza (FLU)-specifici degli stessi pazienti con infezione cronica. Tra i mediatori che intervengono per riparare il danno del DNA, rientrano le poli-ADP- ribosilasi (PARP), enzimi nicotinamide adenina dinucleotide (NAD)-dipendenti come le sirtuine e le ciclo-ADP-ribosio sintasi, tra cui CD38. In particolare, CD38 è noto per essere il maggiore consumatore di NAD, ed è risultato sovra-espresso nei linfociti T HBV-specifici dei pazienti cronici. Partendo dall’ipotesi che la deplezione di NAD possa concorrere alla disfunzione T linfocitaria, si è testato l’effetto della somministrazione in vitro della molecola precursore del NAD Nicotinamide Mononucleotide (NMN) da sola e in combinazione con un inibitore dell’attività NAD-asica del CD38 (78c o CD38i). L’efficacia del singolo trattamento con NMN è risultata ulteriormente potenziata dall’associazione con il CD38i, nel ripristinare la funzionalità T linfocitaria anti-virale. Lo scopo della presente tesi è stato quello di approfondire lo studio dei meccanismi alla base della disfunzione linfocitaria in corso di epatite B cronica, indagando il ruolo dell’up-regolazione di CD38 in tale contesto e verificando che l’accumulo di ROS, e quindi lo stress ossidativo, sia associato alla riduzione della lunghezza dei telomeri. Si è poi caratterizzato l’effetto del trattamento combinato con NMN e inibitore di CD38 non solo sul ripristino dei diversi aspetti alterati descritti, compreso il profilo trascrizionale, la lunghezza dei telomeri e l’acetilazione istonica, ma anche su linfociti specifici per diversi epitopi virali, descritti in letteratura per avere diversi livelli di esaurimento funzionale, inclusi epitopi mutanti. I dati indicano che i linfociti T CD8 HBV-specifici che esprimono elevati livelli di CD38, mostrano più alta espressione di PD-1 e una capacità di rispondere al danno del DNA, così come di produrre la citochina antivirale interferone-γ, molto più compromessa, rispetto ai linfociti che esprimono meno CD38. L’utilizzo di trattamenti con antiossidanti mitocondriali, neutralizzando l’effetto dannoso dei ROS, è in grado di ripristinare significativamente la lunghezza dei telomeri. La deplezione di NAD compromette anche l’acetilazione dell’istone H3 e l’espressione genica di Sirt3, studiata mediante sequenziamento dell’RNA (RNA-Seq). Attraverso questa metodica, è stato inoltre possibile osservare anche che il trattamento con NMN+CD38i influisce sul profilo trascrizionale dei linfociti HBV-specifici exhausted e sulla lunghezza dei telomeri. Inoltre tale trattamento è efficace per recuperare l’acetilazione istonica e ripristinare l’attività antivirale a livelli confrontabili con Entinostat, un farmaco epigenetico ad attività inibitoria sulle istone-deacetilasi (HDAC). In linfociti T CD8 HBV-specifici che riconosco epitopi virali diversi da CORE 18-27, quali epitopi CORE mutati ed epitopi della polimerasi virale, i meccanismi di riparazione del danno del DNA risultano disfunzionali e il trattamento con NMN+CD38i ripristina la funzionalità linfocitaria a livelli confrontabili con quelli osservati per i linfociti T HBV-specifici per il CORE wild type. In conclusione, lo studio riportato nella presente tesi ha permesso di approfondire ulteriormente la conoscenza dei meccanismi alla base dell’exhaustion linfocitaria. Le diverse disfunzioni cellulari, incluso l’accorciamento dei telomeri, risultano interconnesse e correlate all’esaurimento del NAD, suggerendo una somiglianza tra exhaustion T linfocitaria e senescenza cellulare. La carenza di NAD può ridurre anche la disponibilità di Acetil-CoA per l’acetilazione istonica, portando alla condensazione della cromatina e quindi al silenziamento genico. La correzione delle funzioni intracellulari deregolate mediante la supplementazione di NAD in associazione all’inibizione di CD38 è in grado di ripristinare la funzionalità antivirale dei linfociti T CD8 antivirali indipendentemente dall’epitopo riconosciuto e anche in caso di mutanti virali. Tale trattamento rappresenta quindi una potenziale strategia terapeutica per un’immunoterapia finalizzata alla cura dell’infezione cronica da HBV.