Studio longitudinale mediante FISH e significato prognostico dell'eterogeneità genetica intratumorale nella Leucemia Linfatica Cronica

Abstract

Background: La leucemia linfatica cronica (LLC) è la leucemia più diffusa nel mondo occidentale ed è caratterizzata da una estrema eterogeneità clinico-biologica. Alla luce di questa straordinaria eterogeneità, diversi gruppi di studi si sono focalizzati nell’individuare il miglior algoritmo prognostico per la stratificazione dei pazienti. Fino ad ora, nessuno dei modelli proposti è stato universalmente adottato. Sebbene siano stati individuati un gran numero di indici prognostici, le quattro anomalie citogenetiche ricorrenti rilevate dall'ibridazione in situ fluorescente (FISH) sono ancor’oggi considerate i più potenti marker prognostici (in ordine decrescente di avversità: del (17p), del (11q), trisomia 12, no aberrazioni, del (13q)). La classificazione gerarchica di Dohner, basata su queste quattro anomalie, sviluppata più di 15 anni fa, è ancora ampiamente utilizzata nella routine clinica. Tuttavia, la prognosi di ciascun gruppo di rischio citogenetico corrente rimane eterogenea. L’eterogeneità genetica intratumorale (ITH), ovvero la coesistenza di multipli subcloni, potrebbe essere responsabile di questa non uniformità. Inoltre, le tecniche di genome wide hanno identificato anomalie citogenetiche addizionali con rilevanza clinica-patologica. Gli attuali approcci diagnostici, FISH e Citogenetica Convenzionale (CC), potrebbero sottostimare la complessità di LLC. Il primo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di confrontare il tasso di anomalie rilevate dalle tecniche utilizzate nella routine clinica con metodi citogenetici più sofisticati, ovvero Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA), array comparative genomic hybridization + Single Nucleotide Polymorphism arrays (aCGH+SNP array) ed una nuova tecnica di cariotipizzazione basat sulla tecnologia Next Generation Sequencing. Il fine ultimo è stato quello di individuare l'approccio metodologico migliore, che possa superare i limiti della FISH (tecnica targeted) e della CC (bassa risoluzione). Il secondo scopo del lavoro è stata la validazione di un recente algoritmo prognostico che integra il numero e la simultanea presenza delle anomalie citogenetiche ricorrenti e la dimensione dei subcloni genetici intratumorali. Inoltre, abbiamo anche eseguito uno studio longitudinale per 52 pazienti, eseguito a tre diversi time-point, ovvero alla diagnosi, pre-terapia e al follow-up, per valutare l'evoluzione clonale in relazione alla terapia e al decorso della malattia. Materiali e Metodi: Per il primo scopo, eseguito in collaborazione con il Centro di genetica umana dell'ospedale di Leuven (BE), l’analisi di citogenetica convenzionale mediante R-bandong e di FISH è stata eseguita su 10 pazienti. Sono state testate le seguenti sonde: (LSI RB1 (SG) / D13S319 (SO), XL DLEU / LAMP / 12CEN e XL ATM / TP53 (cut-off: 5%). Inoltre i campioni sono stati analizzati mediante: MLPA, utilizzando il SALSA MLPA P038-A2 CLL kit (MRC-Holland), la piattaforma CytoSure Haematological Cancer + SNP Array (8x60k) ed attraverso una nuova metodica di cariotipizzazione molecolare basata sulla tecnologia NGS che consente un sequenziamento multiplex (sequenziamento in parallelo di 14-18 campioni) a bassa copertura (coverage 0.17x e ~ 12x106 per campione) ma ad alta risoluzione. Successivamente, per convalidare il nuovo algoritmo abbiamo analizzato 105 pazienti mai trattati con un follow-up medio di 69 mesi. E’ stata eseguita l’analisi di citogenetica convenzionale mediante Q-banding per 58 pazienti alla diagnosi e per 19 pazienti al follow up. L’analisi FISH è stata eseguita su tutta la casistica, usando il pannello di sonde LLC standard: XL DLEU / LAMP / 12CEN e XL ATM / TP53. Abbiamo distinto un major clone ed un minor clone, se la differenza tra 2 anomalie presenti in un stesso paziente era> 30%. I pazienti sono stati quindi stratificati nei tre gruppi di rischio (favorevole, neutro, avverso) sulla base sia dell’ attuale che del nuovo modello prognostico. La sopravvivenza globale (OS) ed il tempo al primo trattamento (TTFT) sono stati valutati con il metodo di Kaplan Maier e le caratteristiche prognostiche sono state analizzate mediante test log-rank (p <0,05). Risultati Progetto 1: Dalla combinazione di tutte le tecniche, escluso il cariotipo, è stato rilevato un totale di 28 copy number variation (CNV). E’ stato dimostrato che l'analisi FISH sottostima la complessità genomica della LLC. La MLPA non è risultata un valido strumento da introdurre nella pratica clinica, a causa della sua bassa sensibilità. L'analisi genome wide, eseguita mediante aCGH + SNP array e mediante la tecnica di cariotipizzazione basata sulla tecnologia NGS, ha mostrato il più alto tasso di rilevamento delle anomalie, individuando anche lesioni genomiche addizionali (39%), con una buona concordanza statistica con l’analisi FISH. La tecnica di NGS rispetto agli aCGH + SNP è risultata vantaggiosa sia in termini economi ma soprattutto perché caratterizzata da una più alta sensibilità. Tuttavia, questo promettente approccio non consente di rilevare, la copy neutral loss of heterozygosity (CN-LOH), una nuova anomalia con un probabile impatto prognostico. La combinazione di aCGH e SNP array in un unico esperimento è l'unico approccio per il rilevamento di CN-LOH. Nella nostra coorte, sono stati rilevati due casi con CN-LOH in 11q14.3q22.3 e 20q11.21q14. Risultati Progetto 2: Alla diagnosi, l'analisi Q-banding ha mostrato nel 37% dei casi cariotipo anomalo (19/51), il 31% (6/11) dei quali con cariotipo complesso (CK) (≥ 3 anomalie). Durante il follow up, l'analisi Q-banding è stata eseguita in 19 pazienti: 58% (11/19) con cariotipo anormale e sei dei quali con CK. Nell'87% dei pazienti è stata rilevata almeno un'anomalia in FISH: una singola anomalia in 40 (46%) pazienti, due anomalie in 33 (38%), tre anomalie in 12 (14%) e quattro anomalie in 2 (1,9% ) pazienti. Sulla base di questi dati, in combinazione con la dimensione del clone, i pazienti sono stati stratificati nei tre gruppi di rischio: favorevole, intermedio e sfavorevole sia dell’attuale che del nuovo modello prognostico. Il 12% di pazienti è stato ristratificato. Sorprendentemente, è stata osservata una differenza statisticamente significativa nell'OS (p <0,05) tra i tre gruppi di rischio solo adottando il nuovo modello. Inoltre, l’approfondita analisi di composizione clonale mediante FISH ci ha permesso di discriminare tra i pazienti monoclonale (47%) e ITH (17%) e di definire differenti dinamiche clonali: riduzione/eradicazione clonale, stabilità clonale, equilibrio clonale, squilibrio clonale. Lo studio longitudinale ha mostrato nel 25% dei pazienti evoluzione clonale (CE). Le anomali più frequente acquisite nel follow up erano la del(17p) e la monosomia 12. Sebbene il CE fosse maggiormente associata a progressione clinica, è stata rinvenuta anche in pazienti non trattati e con stabilità clinica. Inoltre, è emerso che nei pazienti con ITH la terapia, in particolare l'esposizione alla chemioterapia, può distruggere l'equilibrio clonale stabilitosi tra i diversi cloni, promuovendo la selezione e l'espansione del clone fitter. Nel nostro studio, non vi era alcuna associazione tra presenza di anomalie citogenetiche rinvenute alla diagnosi e CE. Infine, i pazienti con evoluzione clonale hanno mostrato un breve TTFT ma con OS paragonabile ai pazienti senza CE. Conclusioni: Il nostro studio ha rivelato che la tecnica di cariotipizzazione NGS-based potrebbe essere associata alle attuali tecniche diagnostiche. Tuttavia l'analisi FISH, sia per l’alta sensibilità ma soprattutto perché è una metodoca che consente l’analisi su singola cellula consentendo l’individuazione di subcloni emergenti, rimane un potente strumento nel setting clinico dei pazienti con LLC. Inoltre, poiché il significato prognostico delle nuove anomalie cromosomiche non è stato chiaramente definito ad oggi la FISH e la CC non possono essere completamente sostituiti nella diagnosi e nella stratificazione di pazienti con LLC. Sono necessari ulteriori studi per stabilire i criteri standard per la futura applicabilità clinica della nuova e promettente metodica di cariotipizzazione molecolare. Inoltre, abbiamo confermato che il CK rilevato da Q-banding è un indicatore di prognosi sfavorevole. Abbiamo dimostrato che anomalie citogenetiche ad alto rischio se presenti come minor clone mostrano un decorso clinico favorevole. Il nuovo algoritmo di stratificazione, che include il fenomeno dell’ ITH, è più efficace nel predire la sopravvivenza e il TTFT nei pazienti con LLC rispetto all’algoritmo convenzionale. Infine, lo studio longitudinale ha mostrato che la CE è un evento frequente nei pazienti con LLC. Inoltre, l'esposizione alla chemioterapia sembra essere responsabile di una marcata evoluzione clonale. I nostri risultati evidenziano la necessità di analisi FISH sequenziali anche nei pazienti con LLC mai trattati dato che l'insorgenza di clone con del(17p) è stata rinvenuta anche in assenza di trattamento. Sono necessari ulteriori studi longitudinali per definire l'associazione tra dinamiche clonali e decorso clinico, per definire le traiettorie evolutive e per far luce sugli eventi genetici che possono verificarsi nel corso della malattia e che possono spiegare resistenza al trattamento ed una breve sopravvivenza. In conclusione, la ricerca di ITH alla diagnosi e/o al momento del primo trattamento potrebbe predire l'evoluzione clonale e la generazione di subcloni resistenti alla terapia.

Background: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common adult leukemia of the Western world and it is characterized by an extreme clinical and biological heterogeneity. In view of this extraordinary heterogeneity, several research groups are focused on finding the best prognostic algorithm for the patients’ stratification. Until now, none has universally adopted. Although a plethora of prognostic indices have been proposed, the four cytogenetic abnormalities detected by Fluorescent In Situ Hybridation (FISH) are considered highly powerful prognostic markers [in descending order of adversity: del(17p), del(11q), trisomy 12, no aberrations, and del(13q)]. The hierarchal Dohner classification, based on these four abnormalities and developed more than 15 years ago, is still widely used in the clinical routine. However, the prognosis of each current cytogenetic risk group remains heterogeneous; and the coexistence of multiple and different subclones, also known as Intratumoral Genetic Heterogeneity (ITH), may contribute to this nonuniformity. In addition, the genome wide techniques has identified additional cytogenetic recurrent abnormalities with potentially clinicopathologic relevance. The current diagnostic approaches, FISH and Conventional Cytogenetic (CC), could understate the LLC complexity. First, our purpose was to compare the abnormalities detection rate of three different cytogenetic methods [Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA), array comparative genomic hybridization plus Single Nucleotide Polymorphism arrays (aCGH+SNP array) and a novel Next Generation Sequencing-based molecular karyotyping technique] with the current routinely used approaches. The goal was to evaluate the best approach for the routine CLL diagnostic setting, to overcome the limitations of FISH (a targeted test that provides a limited view on the genomic landscape) and CC (a test with low resolution). Next, we aimed to validate a novel prognostic algorithm that integrated the number and the co-occurrence of recurrent cytogenetic abnormalities and the size of intratumoral genetic subclones. In addition, we performed a longitudinal study for 52 patients with sequential samples (at diagnosis, pre-therapy, and follow up) to track the clonal evolution, particularly in relation to therapy and the course of the disease. To get insights into clonal composition, we performed an in-depth molecular cytogenetic analysis by means of two-colour probe sets. Methods: For the first purpose, performed in collaboration with the Center of Human Genetics of General Hospital of Leuven (BE), we collected peripheral blood (PB) samples from 10 CLL patients. All patients were analyzed by R-banding after short-term culture. We performed a FISH analysis, using commercially available probes [(LSI RB1(SG)/D13S319(SO), XL DLEU/LAMP/12CEN and XL ATM/TP53 probe set (cut-off: 5%)], MLPA analysis using a SALSA MLPA P038-A2 CLL kit designed by MRC-Holland, CytoSure Haematological Cancer + SNP Array (8x60k) platform and a novel, cost-effective NGS-based karyotyping, which allows a multiplex sequencing (14-18 samples per lane) with low coverage (0.17x and ~12x106 reads for sample) but with high-resolution of whole-genome. Next, to validate the novel algorithm we analyzed 105 patients at diagnosis and/or before starting treatment by Q-banding analysis and FISH with a standard panel probes: XL DLEU/LAMP/12CEN and XL ATM/TP53.We distinguished a major or minor clone, if the difference between two coexistent abnormalities in each patient was >30%. Patients were then stratified in three groups (favorable, neutral, adverse) on the basis of the current and novel prognostic model. Overall survival (OS) and Time to First Treatment (TTFT) were assessed by Kaplan Maier method and the prognostic features were evaluated by log-rank test (p<0.05) with a median follow-up of 69 months. Aim I results: Overall, a total of 28 copy number variations (CNV) was detected by a combination of all the techniques, excluding karyotype. We demonstrated that FISH analysis underestimated the genomic complexity in CLL and the MLPA test was not a robust tool for the CLL clinical setting, owing to its low sensitivity. The genome wide analysis, performed by aCGH + SNP array and by NGS-based karyotyping, showed the highest abnormality detection rate revealing additional genomic lesions (39%) with good statistical concordance compared to FISH-detectable CNV. The novel NGS-based karyotyping against to aCGH + SNP array showed high sensitivity and cost-effective advantages. However, this promising approach does not detect, the copy neutral loss of heterozygosity (CN-LOH), a novel abnormality with probable prognostic impact. The combination of aCGH and SNP array is the only approach for detection of CN-LOH. In our cohort, two cases with 11q14.3q22.3 and 20q11.21q14 CN-LOH were detected. Aim II Results: At diagnosis, Q-banding analysis showed 37% of abnormal karyotype (19/51) with 31% (6/11) of complex karyotype (CK) (≥3 abs). During follow up, Q-banding analysis was performed in 19 patients: 58% (11/19) with abnormal karyotype and six of them with CK. In 87% of the patients at least one FISH abnormality was detected as follows: a single, two, three, four aberrations in 40 (46%), 33 (38%), 12 (14%) and 2 (1,9%) patients, respectively. Based on this data, in combination with the clone size, we stratified patients into favorable, neutral and adverse groups of the current and new model respectively. Out of 105 patients, 12% of them were restratified. Surprisingly, a statistically significant difference in OS (p<0.05) among the three groups was observed only by adopting the novel model. In addition, the in-depth FISH analysis on clonal composition allowed us to discriminate between monoclonal (47%) and ITH patients (17%) and to define different clonal dynamics: clonal size reduction, clonal stability, clonal equilibrium, clonal imbalance. The longitudinal study showed clonal evolution (CE) in 25% of the patients and del(17p) and monosomy 12 were the most frequent aberrations acquired at follow up. Although the CE was more associated with clinical progression, it appeared in untreated patients with clinical stability, as well. In ITH patients the therapy, especially chemotherapy exposure, could destroy the clonal equilibrium between different clones, promoting the expansion of the highly fit clone. In our study, there was no association between presence of baseline cytogenetic abnormalities and CE. Finally, patients with clonal evolution showed a short TTFT but the OS was comparable with patients without CE. Conclusion: Our study revealed NGS-based karyotyping could complement the current diagnostic techniques, but FISH analysis remains a powerful tool in the clinical CLL setting, especially due to its high sensitivity and its ability to study a single cell, allowing for the evaluation of emerging subclones. Moreover, the prognostic value of novel chromosomal abnormalities has not been clearly revealed. For these reasons, until now, FISH and CC could not completely be replaced for CLL diagnosis and stratification. Further studies are needed to establish a standard criteria for future clinical applicability of NGS karyotyping. In addition, we confirmed that the CK detected by Q-banding was a poor prognosis marker. We demonstrated that the high-risk cytogenetic abnormality as a minor clone showed a favorable clinical course and the new stratification algorithm, including ITH, was superior to the conventional model in predicting survival and the TTFT in patients with CLL. Finally, the longitudinal study showed that CE was a common finding in patients with CLL. Moreover the chemotherapy exposure frequently resulted in marked clonal evolution. Our results highlight the need of sequential FISH analysis in patients with CLL even in absence of treatment because we found the onset of clone with del(17p) even in untreated patient. Further longitudinal study are needed to define the association between clonal dynamics and the clinical status, to track the evolutionary trajectories and to shed light on the relevant genetic events which occur over the course of the disease that can explain treatment resistance and a short outcome. In conclusion, searching for ITH at diagnosis and/or at the time of first treatment could predict clonal evolution and the generation of therapy-resistant subclones.