Transthyretin and Retinol-Binding-Protein system: from functional and structural properties to pathological implications

Abstract

L’ormone tiroideo tiroxina (T4) e la vitamina A giocano un ruolo fondamentale nella regolazione del ciclo cellulare e nella differenziazione. Il trasporto di queste molecole a livello plasmatico viene garantito da due specifici trasportatori proteici che sono rispettivamente la transtiretina (TTR) e la retinol binding protein (RBP). TTR e RBP vengono prodotte negli epatociti e secrete nel circolo sanguigno, in cui formano un complesso relativamente stabile. Entrambe sono associate a stati patologici: le amiloidosi nel caso della TTR e la cecità notturna e malformazioni congenite dell’occhio nel caso della RBP. In questo lavoro, le proteine del sistema TTR-RBP sono stato studiate sotto differenti aspetti. La prima linea di ricerca sulla TTR ha riguardato la valutazione dell’attività antiamiloidogenica di un composto di sintesi noto come CSP-1103, un derivato clorurato del Flurbiprofene, inizialmente sviluppato da Chiesi Farmaceutici per il trattamento del morbo di Alzheimer. La stabilizzazione dello stato nativo della TTR da parte di questo ligando è stata comparata con quella di altri due farmaci, approvati dalla Food and Drug Administration (FDA): Tafamidis e Diflunisal. Il CSP-1103 possiede una alta affinità per i siti di legame della TTR ed è in grado di stabilizzarne lo stato nativo in prove di denaturazione in vitro e ex vivo, in maniera paragonabile al Diflunisal, ma in minor misura rispetto al Tafamidis. Inoltre, considerando la sua capacità di attraversare la barriera emato-encefalica, l’effetto stabilizzante del CSP-1103 è stato testato su una specifica variante mutante della TTR (A25T) associata all’amiloidosi leptomeningea, caratterizzata dalla deposizione di fibrille nelle leptomeningi. La seconda linea di ricerca ha riguardato la retro-evoluzione della TTR ad idrossiisourato idrolasi (HIUasi), un enzima ancestrale assente nell’uomo per il quale un evento di duplicazione genica ha generato la TTR. Lo scopo è stato quello di verificare la possibilità di ricreare un sito attivo enzimatico nel sito di legame della TTR umana, sostituendo residui della TTR con residui che occupano la stesa posizione nella sequenza amminoacidica delle HIUasi da diverse specie, nelle quali questi residui sono conservati e quindi presumibilmente rilevanti per la catalisi. Il fine ultimo, dal punto di vista applicativo, era quello di ottenere una proteina con uno scaffold proteico umano, non immunogenico, di potenziale impiego terapeutico per il trattamento delle iperuricemie. L’inserimento di cinque mutazioni nel sito di legame della T4, ci ha permesso di ottenere cinque forme mutanti, una delle quali ha mostrato un’attività enzimatica 2000 volte più bassa rispetto a quella dell’HIUasi di Danio rerio, utilizzata come confronto. Questo mutante ha mantenuto la capacità di interagire normalmente con la RBP in accordo con il fatto che l’inserimento delle mutazioni non ha avuto ripercussioni sulla struttura quaternaria della TTR. Riguardo alla RBP, Chou et al. (2015) hanno recentemente identificato due mutanti patologici (A55T e A57T) correlati ad una forma autosomica dominate di microftalmia, anoftalmia e coloboma (MAC). Questi autori hanno suggerito come il ruolo patologico di queste forme mutanti possa essere associato alle forme apo, le quali mostrano una maggiore affinità per il recettore di membrana STRA6, rispetto alla RBP wt. Al fine di chiarire ulteriormente le proprietà alla base della loro patogenicità, le forme mutanti della RBP sono state espresse in E.coli, ed è stato possibile ottenerle in forma nativa mediante un procedimento di unfolding, refolding in presenza di retinolo e cromatografia di affinità, sfruttando per quest’ultima l’interazione TTR-RBP. Le due forme mutanti di olo-RBP che abbiamo analizzato hanno mostrato caratteristiche funzionali simili a quelle descritte da Chou et. al (2015) quali la capacità di interagire con il retinolo e la TTR. Inoltre, abbiamo osservato un alto grado di similarità tra le strutture della olo-RBP A57T e della olo-RBP wt. Nonostante queste caratteristiche, in condizioni denaturanti, le forme mutanti mostrano un maggiore grado di instabilità rispetto alla RBP wt, e questo dato è probabilmente in accordo con le alterazioni patologiche indotte in vivo dalle mutazioni.

The thyroid hormone thyroxine (T4) and Vitamin A play a key role in cell cycle regulation and differentiation. The transport of these molecules in plasma is guaranteed by two specific transporters which are transthyretin (TTR) and retinol binding protein (RBP), respectively. TTR and RBP are produced in hepatocytes and secreted into the bloodstream, where they form a relatively stable complex. Both proteins are associated with different diseases: TTR amyloidoses and night blindness and congenital eye malformations in the case of RBP. In this study, the proteins of the TTR-RBP system have been studied for different purposes. The first line of research on TTR concerned the assessment of the antiamiloidogenic activity of a synthetic compound known as CSP-1103, a chlorinated derivative of Flurbiprofen, initially developed by Chiesi Farmaceutici for the treatment of Alzheimer's disease. The TTR native state stabilization by this ligand was compared with that of two FDA-approved drugs: Tafamidis and Diflunisal. CSP-1103 possesses a high affinity for TTR binding sites and it is able to stabilize TTR, in in vitro and ex vivo experiments, in a manner comparable to Diflunisal, although to a lower extent in comparison with Tafamidis. In addition, considering its peculiar ability to cross the blood brain barrier, the stabilizing effect of CSP-1103 was assessed for a specific TTR mutant form (A25T) associated with leptomeningeal amyloidosis, in which fibril deposition takes place in the leptomeninges. The second line of research focused on the retro-evolution of TTR into hydroxyisourate hydrolase (HIUase), the ancestral protein whose gene duplication event generated TTR. The purpose was to verify the possibility of recreating an enzyme active site by replacing TTR residues with residues that occupy the same position in the amino acid sequence of HIUase from different species, in which these residues are conserved and are, therefore, presumably relevant for catalysis. The ultimate goal, from the application point of view, was to obtain an enzyme with the scaffold of a human protein, and therefore non-immunogenic, of potential therapeutic use for treatment of hyperuricemia. The insertion of five substitutions, in the T4 binding site of TTR, allowed us to obtain five mutant forms, one of which displayed an enzymatic activity about 2000 fold lower than that of Danio rerio HIUase, used as reference. This mutant form maintains the ability to interact with the usual affinity with RBP, suggesting that the introduced mutations do not affect the overall protein structure of TTR. Regarding RBP, recently two pathological mutants forms (A55T and A57T), related to an autosomal dominant form of MAC (microphtalmia, anophtalmia and coloboma) disease, were discovered by Chou et al. (2015). These authors suggested that the pathological role of these mutant forms could be ascribed to the apo-RBP forms, which exhibit a higher affinity for the RBP membrane receptor STRA6, in comparison with wt RBP. To further clarify the properties underlying their pathogenicity, the RBP mutants were heterologously expressed in E. coli, and could be obtained in native form by a process that required unfolding, refolding in the presence of retinol and affinity chromatography, taking advantage of the specific TTR-RBP interaction. The two mutated holo-RBPs we have analyzed showed functional characteristic similar to those described by Chou et al. (2015), i.e. the ability to interact with both retinol and TTR. Moreover, we have obtained evidence for a high degree of structural similarity between holo-RBP A57T and wt holo-RBP. Despite such features, we have observed a significantly higher protein destabilization, under denaturing conditions, for hRBP A55T and A57T as compared to wt hRBP possibly consistent with the pathological alterations induced in vivo.