Determinants of biological activity of nanomaterials in innate immunity cells: the role of aspect ratio, environmental contaminants and protein corona

Abstract

As defined by the European Union, “ ’Nanomaterial’ (NM) means a natural, incidental or manufactured material containing particles, in an unbound state or as an aggregate or agglomerate, where, for 50 % or more of the particles in the number size distribution, one or more external dimensions is in the size range 1 nm-100 nm ” (2011/696/UE). Given their peculiar physico-chemical features, nanostructured materials are largely used in many industrial fields (e.g. cosmetics, electronics, agriculture, biomedical) and their applications have astonishingly increased in the last fifteen years. Nanostructured materials are endowed with very large specific surface area that, besides making them very useful in many industrial processes, renders them very reactive towards the biological systems and, hence, potentially endowed with significant hazard for human health. For these reasons, in recent years, many studies have been focused on the identification of toxic properties of nanostructured materials, investigating, in particular, the mechanisms behind their toxic effects as well as their determinants of toxicity. This thesis investigates two types of nanostructured TiO2 materials, TiO2 nanoparticles (NP), which are yearly produced in tonnage quantities, and TiO2 nanofibres (NF), a relatively novel nanomaterial. Moreover, several preparations of MultiWalled Carbon Nanotubes (MWCNT), another nanomaterial widely present in many products, are also investigated.- Although many in vitro and in vivo studies have characterized the toxic properties of these materials, the identification of their determinants of toxicity is still incomplete. The aim of this thesis is to identify the structural determinants of toxicity, using several in vitro models. Specific fields of investigation have been a) the role of shape and the aspect ratio in the determination of biological effects of TiO2 nanofibres of different length; b) the synergistic effect of LPS and TiO2 NP on the expression of inflammatory markers and the role played therein by TLR-4; c) the role of functionalization and agglomeration in the biological effects of MWCNT. As far as biological effects elicited by TiO2 NF are concerned, the first part of the thesis demonstrates that long TiO2 nanofibres caused frustrated phagocytosis, cytotoxicity, hemolysis, oxidative stress and epithelial barrier perturbation. All these effects were mitigated by fibre shortening through ball-milling. However, short TiO2 NF exhibited enhanced ability to activate acute pro-inflammatory effects in macrophages, an effect dependent on phagocytosis. Therefore, aspect ratio reduction mitigated toxic effects, while enhanced macrophage activation, likely rendering the NF more prone to phagocytosis. These results suggest that, under in vivo conditions, short NF will be associated with acute inflammatory reaction, but will undergo a relatively rapid clearance, while long NF, although associated with a relatively smaller acute activation of innate immunity cells, are not expected to be removed efficiently and, therefore, may be associated to chronic inflammatory responses. As far as the relationship between the effects of TiO2 NP and LPS, investigated in the second part of the thesis, are concerned, TiO2 NP markedly enhanced macrophage activation by LPS through a TLR-4-dependent intracellular pathway. The adsorption of LPS onto the surface of TiO2 NP led to the formation of a specific bio-corona, suggesting that, when bound to TiO2 NP, LPS exerts a much more powerful pro-inflammatory effect. These data suggest that the inflammatory changes observed upon exposure to TiO2 NP may be due, at least in part, to their capability to bind LPS and, possibly, other TLR agonists, thus enhancing their biological activities. Finally, the last part of the thesis demonstrates that surface functionalization of MWCNT with amino or carboxylic groups mitigates the toxic effects of MWCNT in terms of macrophage activation and capability to perturb epithelial barriers. Interestingly, surface chemistry (in particular surface charge) influenced the protein adsorption onto the MWCNT surface, allowing to the formation of different protein coronae and the tendency to form agglomerates of different size. In particular functionalization a) changed the amount and the type of proteins adsorbed to MWCNT and b) enhanced the tendency of MWCNT to form large agglomerates. These data suggest that the different biological behavior of functionalized and pristine MWCNT may be due, at least in part, to the different tendency to form large agglomerates, which is significantly influenced by their different capability to interact with proteins contained in biological fluids. All together, these data demonstrate that the interaction between physico-chemical properties of nanostructured materials and the environment (cells + biological fluids) in which these materials are present is of pivotal importance for the understanding of the biological effects of NM. In particular, bio-persistence and the capability to elicit an effective inflammatory response are attributable to the interaction between NM and macrophages. However, the interaction NM-cells is heavily influenced by the formation at the nano-bio interface of specific bio-coronae that confer a novel biological identity to the nanostructured materials, setting the basis for their specific biological activities.

Come definito dall’Unione Europea, con il termine nanomateriale si intende “ un materiale di origine naturale, accidentale o industriale contenente particelle, in uno stato non aggregato, aggregato o agglomerato, in cui almeno il 50% delle particelle ha almeno una dimensione compresa tra 1 e 100 nm ” (2011/696/UE). I materiali nanostrutturati, date le loro peculiari caratteristiche fisico-chimiche, sono largamente impiegati in numerosi settori industriali (es. cosmetica, elettronica, agricoltura, campo biomedicale) e il loro utilizzo è cresciuto esponenzialmente negli ultimi quindici anni. I materiali nanostrutturati sono caratterizzati da una notevole area superficiale che, nonostante li renda molto utili in numerosi processi industriali, li rende estremamente reattivi nei confronti dei sistemi biologici e, quindi, potenzialmente pericolosi per la salute umana. Per questi motivi, negli ultimi anni, numerosi studi si sono focalizzati sull’identificazione delle proprietà tossiche dei materiali nanostrutturati, studiando in particolar modo i meccanismi alla base dei loro effetti tossici così come i loro determinanti strutturali di tossicità. In questa tesi si studieranno due materiali nanostrutturati di TiO2, le nanoparticelle (TiO2 NP), la cui produzione consiste di decine di tonnellate ogni anno, e le nanofibre (TiO2 NF), un materiale relativamente nuovo. Inoltre saranno oggetto di studio anche diverse preparazioni di nanotubi di carbonio a parete multipla (MWCNT), un altro nanomateriale a larga diffusione. Nonostante le proprietà tossiche di questi materiali siano state caratterizzate in numerosi studi in vivo e in vitro, l’identificazione dei determinanti di tossicità dei NM risulta ancora incompleta. Lo scopo di questa tesi consiste nell’identificazione di determinanti strutturali di tossicità, utilizzando diversi modelli in vitro. Più nello specifico si è indagato a) il ruolo della morfologia e dell’aspect ratio nella determinazione degli effetti biologici prodotti da TiO2 NF di diversa lunghezza; b) l’effetto sinergico di LPS e TiO2 NP sull’espressione di marker infiammatori e il ruolo del TLR-4 in questo fenomeno; c) il ruolo della funzionalizzazione e dell’agglomerazione nella determinazione degli effetti biologici dei Nanotubi di Carbonio a Parete Multipla (MWCNT). Per quanto riguarda gli effetti biologici prodotti dalle TiO2 NF, nella prima parte della tesi si dimostra che TiO2 NF lunghe causano fagocitosi frustrata, citotossicità, emolisi, stress ossidativo e alterano l’integrità della barriera epiteliale. Tutti questi effetti erano mitigati dall’accorciamento delle fibre attraverso il processo di ball-milling. Al contrario, le TiO2 NF corte erano in grado di stimolare maggiormente l’espressione di marker infiammatori acuti nei macrofagi, un effetto dipendente dalla fagocitosi. La riduzione dell’aspect ratio, quindi, mitigava gli effetti tossici, mentre stimolava maggiormente l’attivazione dei macrofagi, fenomeno riconducibile ad un’aumentata fagcocitosi di queste fibre. Questi risultati suggeriscono che, in vivo, le NF corte potrebbero essere associate a una reazione infiammatoria acuta ma, parallelamente, essere soggette ad una clearance relativamente più rapida. Al contrario, le NF lunghe, stimolando in misura minore fenomeni di attivazione macrofagica, potrebbero essere rimosse in maniera meno efficiente e, quindi, essere associate a fenomeni infiammatori cronici. Per quanto riguarda la relazione tra gli effetti delle TiO2 NP e del LPS, approfondite nella seconda parte della tesi, è stato dimostrato che le nanoparticelle potenziavano fortemente l’attivazione dei macrofagi indotta dal LPS mediante un pathway intracellulare mediato dal recettore TLR-4. L’adsorbimento del LPS sulla superficie delle TiO2 NP portava alla formazione di una specifica bio-corona, indicando che, quando legato alle TiO2 NP, il LPS induce effetti pro-infiammatori significativamente maggiori. Questi dati suggeriscono che i fenomeni infiammatori osservati in seguito all’esposizione alle TiO2 NP potrebbero essere dovuti, almeno parzialmente, alla loro capacità di legare il LPS e, probabilmente, altri agonisti dei TLR, aumentandone l’attività biologica. E’ stato infine valutato il ruolo della funzionalizzazione e dell’agglomerazione negli effetti biologici di MWCNT, ed è stato dimostrato che la funzionalizzazione superficiale dei MWCNT con gruppi aminici o carbossilici mitigava gli effetti tossici dei MWCNT in termini di attivazione di macrofagi e di alterazione delle barriere epiteliali. La chimica di superficie (in particolare la carica superficiale) influenzava l’adsorbimento di proteine sulla superficie dei MWCNT, portando alla formazione di diverse bio-corone e influenzando la tendenza a formare agglomerati di differenti dimensioni. Questi risultati suggeriscono che il diverso comportamento biologico dei MWCNT pristini e funzionalizzati potrebbe essere associato, almeno in parte, alla differente tendenza a formare grandi agglomerati, che, a sua volta, sembrerebbe influenzata in maniera significativa dalla differente capacità di interagire con le proteine presenti nei fluidi biologici. In conclusione, i dati presentati in questa tesi dimostrano che la comprensione degli effetti biologici dei nanomateriali richiede non solo la caratterizzazione delle loro proprietà fisico-chimiche ma, soprattutto, delle interazioni tra essi e l’ambiente biologico (cellule + fluidi biologici). In particolare, la biopersistenza e la capacità di determinare un’efficace risposta infiammatoria sono attribuibili all’interazione con i macrofagi. Inoltre, l’interazione tra cellule e materiali è notevolmente influenzata dalla formazione di specifiche bio-corone all’interfaccia bio-nano. La formazione della bio-corona conferisce una nuova identità biologica ai materiali nanostrutturati, costituendo così la base per specifiche attività biologiche.