Ruolo di Clusterina nella progressione del tumore prostatico

Abstract

Clusterina (CLU) è una proteina ubiquitaria, presente nella maggior parte dei fluidi corporei e implicata in svariati processi fisiologici. Dalla sua scoperta fino ad oggi, CLU è risultata essere una proteina enigmatica, la cui funzione non è ancora stata compresa appieno. Il gene codifica per 3 varianti trascrizionali identificate nel database NCBI con i codici: NM_001831 (CLU 1 in questo lavoro di tesi), NR_038335 (CLU 2 in questo lavoro di tesi) e NR_045494 (CLU 3 in questo lavoro di tesi). Tutte le varianti sono trascritte come pre-mRNA contenenti 9 esoni e 8 introni e si differenziano per l’esone 1, la cui sequenza è unica e caratteristica di ogni variante. Sebbene in NCBI sia annotato che le varianti CLU 2 e CLU 3 non sono codificanti, tramite analisi bioinformatica è stato predetto che da tutti e tre i trascritti possono generarsi proteine di differente lunghezza e localizzazione cellulare. Tra tutte le forme proteiche ipotizzate, l’unica a essere stata isolata e sequenziata è quella tradotta dall’AUG presente sull’esone 2 che dà origine a una proteina di 449 aminoacidi. Il processo di maturazione prevede la formazione di un precursore citoplasmatico (psCLU) che subisce modificazioni post-traduzionali tra cui formazione di ponti disolfuro, glicosilazioni, taglio in due catene denominate β e α prima di essere secreta come eterodimero βα (sCLU) nell’ambiente extracellulare, dove esercita la sua funzione di chaperone ATP-indipendente. Oltre alla forma extracellulare, è possibile osservare una forma intracellulare con localizzazione citosolica la cui funzione non è stata ancora completamente chiarita. Questo lavoro di tesi si è prefissato lo scopo di incrementare le conoscenze in merito ai trascritti CLU 1 e CLU 2 e alla loro regolazione, oltre ad approfondire il ruolo della forma citosolica della proteina in relazione al signaling di NF-kB che svolge un ruolo importante nel processo di sviluppo e metastatizzazione del tumore. Nella prima parte, uno screening di differenti linee cellulari, quali cellule epiteliali di prostata e di mammella, sia normali sia tumorali, fibroblasti di origine polmonare e linfociti di tumore non-Hodgkin, ha permesso di caratterizzare i trascritti CLU 1 e CLU 2. Dall’analisi è emerso che la sequenza di CLU 1 è più corta al 5’ rispetto a quella depositata in NCBI con l’identificativo NM_001831 e il primo AUG disponibile per l’inizio della traduzione è localizzato sull’esone 2. È stato dimostrato che CLU 2, al contrario di quanto riportato in NCBI, è tradotto in proteina a partire dall’AUG presente sull’esone 2, allo stesso modo in cui viene tradotto CLU 1. Inoltre, è stato osservato che i livelli d’espressione dei trascritti variano notevolmente tra le diverse linee cellulari e nelle cellule epiteliali CLU 2 è espressa sempre a bassi livelli. In queste cellule, l’espressione di CLU 2 è silenziata per via epigenetica e la somministrazione di farmaci capaci di rendere la cromatina più accessibile, quali tricostatina A e 5-aza-2’-deossicitidina, è in grado di incrementarne l’espressione. Nella seconda parte, un’analisi bioinformatica seguita da saggi di attività in vitro in cellule epiteliali prostatiche trattate con farmaci epigenetici, hanno permesso di identificare, per la prima volta in uomo, una seconda regione regolatrice denominata P2, capace di controllare l’espressione di CLU 2. Rispetto a P1, il classico promotore di CLU già ampiamente studiato da altri gruppi di ricerca, P2 è un promotore debole, privo di TATA box, che nelle cellule epiteliali prostatiche è silente in condizioni basali e la cui attività incrementa in seguito alla somministrazione di farmaci epigenetici capaci di alterare le modificazioni post-traduzionali delle code istoniche nell’intorno di P2. Ne consegue un rilassamento della cromatina e un successivo aumento di trascrizione di CLU 2. La presenza di un’isola CpG differentemente metilata nell’intorno di P1 spiegherebbe, almeno in parte, i differenti livelli di espressione di CLU che si osservano tra le diverse linee cellulari. Nella terza parte, l’analisi del pathway di NF-kB in un modello sperimentale di tumore prostatico in cui CLU è stata silenziata o sovraespressa, ha permesso di capire come la forma citosolica di CLU abbia un ruolo inibitorio nei confronti dell’attività del fattore trascrizionale NF-kB. CLU inibisce la fosforilazione e l’attivazione di p65, il membro più rappresentativo della famiglia NF-kB, con conseguente riduzione della trascrizione di alcuni geni da esso regolati e coinvolti nel rimodellamento della matrice extracellulare, quali l’urochinasi attivatrice del plasminogeno, la catepsina B e la metallo proteinasi 9. È stato dimostrato che tale inibizione non è dovuta a un’interazione fisica diretta tra CLU e p65, per cui si suppone che CLU interagisca con uno dei componenti più a monte della via di segnalazione responsabile della fosforilazione ed attivazione di p65.

Clusterin (CLU) is a secreted glycoprotein with a broad distribution in human tissues and body fluids. It is involved in many biological processes, but its function is not completely understood. The human CLU gene encodes for three known mRNA variants currently listed in the NCBI database as NM_001831, NR_038335 and NR_045494, here named CLU 1, CLU 2 and CLU 3 respectively. All variants are transcribed as pre-mRNAs and comprise 9 exons and 8 introns. Exon 1 sequences are unique to each of the three mRNAs. Although in NCBI CLU 2 and CLU 3 are listed as non-coding mRNAs, bioinformatics analysis has predicted that all variants are translated in proteins with different length and cellular localization. Among all protein forms hypothesized, the only one isolated and sequenced is translated from the AUG present on exon 2. This translation produces a 449 amino acids citoplasmatic precursor (psCLU) which undergoes to post-translational modifications before its secretion as heterodimer (sCLU) in the extracellular environment, where it acts as an ATP-independent chaperone. In addition to the extracellular protein, it is possible to find a intracellular form with a not well-understood function. The aim of this thesis is to increase the knowledge about CLU 1 and CLU 2 transcripts and their regulation as well as the role of the intracellular protein in relationship with NF-kB signaling. We investigated CLU 1 and CLU 2 expression in a panel of different cell lines, with a special focus on prostate cancer cells. We found out that CLU 1 is shorter at its 5’ end than the NM_001831 sequence and the translation start site is on exon 2. Despite the information reported in NCBI, we demonstrated that CLU 2 mRNA is translated starting from the AUG on exon 2. The protein products of CLU 1 and CLU 2 are therefore identical and correspond to sCLU. The expression levels of CLU 1 and CLU 2 are different in the analyzed cell lines and, in particular, CLU 2 is expressed at low levels in prostate epithelial cells. Here, CLU 2 is epigenetically silenced and the administration of drugs able to relax the chromatin, such as trichostatin A and 5-aza-2'-deoxycytidine, increased CLU 2 expression. We demonstrated the presence of a new promoter region (P2) that directly drives the expression of CLU 2 by a bioinformatics analysis followed by in vitro assays in prostate epithelial cancer cell lines treated with epigenetic drugs. P2 is a TATA less, GC rich promoter, which remains silent in prostate cancer cells under basal conditions and becomes active after the administration of epigenetic drugs. The mechanism responsible of CLU 2 derepression is the dynamic remodeling of histone tails associate with P2. At last, we evaluated the role of intracellular CLU in relationship with the NF-kB pathway, using an experimental model of prostate cancer cell where CLU has been silenced or overexpressed. We observed that intracellular CLU inhibits the phosphorylation and activation of p65, the most representative member of NF-kB family. The consequence is a reduced transcription of some genes regulated by NF-kB and involved in the extracellular matrix remodeling like urokinase-type plasminogen activator, cathepsin B and matrix metallopeptidase 9. We demonstrated that CLU does not physically interact with p65, but its action is indirect.