Towards the identification of structural determinants of toxicity of amorphous silica nanoparticles and carbon nanotubes: an in vitro study

Abstract

Nanomaterials (NM) contain particles, in an unbound state or as an aggregate or as an agglomerate, which, for a percentage of 50% or more, have one or more external dimensions in the range 1-100 nm. The great development of nanotechnology has produced an increasing quantity of nanomaterials of different types in several productive sectors (food, chemicals, pharmaceuticals). For this reason, several studies are aimed at characterizing the physical and chemical properties of nanomaterials and the determination of their effects on human health and the environment. Multi walled carbon nanotubes (MWCNT) and amorphous silica nanoparticles (ASNP) are examples of nanomaterials widely used in many industrial fields. The overall aim of this thesis is the elucidation of the potential hazards of MWCNT and ASNP, evaluating their interaction with relevant cell models. Attention is given to the assessment of potential toxic effects on cells of innate immunity and to the identification of structural determinants of toxicity. Since inhalation is the major way of interaction with nanomaterials, we decided to study the biological effects of MWCNT and ASNP on two cell lines (MH-S and RAW264.7), as representative models of macrophages, which are the first to contact the inhaled particles, and on airway epithelial cells (Calu-3), which represents one of the first body barriers encountered by nanomaterials dispersed in the environment. The first part of the thesis is focused on the identification of structural determinants of toxicity, in vitro, of four preparations of multi-walled carbon nanotubes with different length, morphology (rigid, needle-like or flexible, tangle-like shape), and level of metal contaminants. We have assessed the biological effects of the four MWCNT preparations (NM400, NM401, NM402 and MWCNT-SA) on macrophages and airway epithelial cells, in order to identify the determinants of toxicity, thus far incompletely elucidated. To study the biological effects of MWCNT on macrophage cell lines we analyzed different endpoints, such as cell viability, phagocytic activity and pro-inflammatory M1 macrophage activation. We found that the main determinants of toxicity for macrophages are the length and the needle-like shape, which hinder, or even prevent, phagocytosis. Indeed, the greater toxicity of NM401 and MWCNT-SA, as demonstrated by the decrease in cell viability and the alteration of functional activity, are ascribable to their greater length and to their morphological features. On the contrary, reduced length and tangle-like shape (NM400 and NM402) promote M1 macrophage activation. Since these materials can be engulfed by macrophages, these results suggest that phagocytosis is a main step for the M1 macrophage activation by nanomaterials, endowed with low acute toxicity. Given the high tendency of MWCNT to aggregate and the presence of aggregates in the airway walls of exposed animals, as reported in several in vivo studies, we have investigated if MWCNT produced a barrier impairment. The behavior of epithelial cells was studied both at the monolayer (cell population) and at the single-cell level. At a cell-population level, Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER) was used as a synthetic indicator of barrier competence, caspase activity was assessed with standard biochemical assays, and cell viability was investigated with both standard biochemical techniques and an high throughput (HTP) technique, based on automated epifluorescence microscopy; at single-cell level, cell responses to MWCNT were investigated with confocal microscopy, by evaluating cell death (calcein/propidium iodide), proliferation (Ki-67), inflammation triggering (NF-B) and apoptosis (caspase activity). We found that the main determinant of toxicity for epithelial cells depends on the actual shape in which MWCNT get in contact with the cells and, in particular, if they form aggregates. The second part of the thesis is focused on the identification of structural determinants of toxicity of two preparations of amorphous silica nanoparticles (ASNP, a material usually considered endowed with modest toxicity). This study has evaluated the capability of ASNP, of comparable size and specific surface area, but produced through different synthetic procedures (colloidal NM200 vs pyrogenic NM203), to induce macrophage activation in MH-S and RAW264.7 cell lines. To study the biological effects of ASNP we analyzed different endpoints, such as cell viability, oxidative stress (ROS formation and the induction of Hmox-1), the induction of the inducible nitric oxide synthase Nos2, the production of NO and the secretion of cytokines like TNF-α, IL-6 and IL-1β. Helium Ion microscopy (HIM) and confocal microscopy were adopted for imaging the interaction between ASNP and the cell surface. The results demonstrate that pyrogenic ASNP are more potentially inflammogenic than colloidal ASNP. Moreover, an additional mechanism of toxicity is proposed, consisting in the greater capability of pyrogenic ASNP to bind biologically active compounds, such as LPS, enhancing their effects. Thus we found that the preparation route procedure may constitute a main determinant of toxicity of ASNP, likely because of the different surface chemistry established by high-temperature synthesis. In conclusion, this thesis highlights that determinants of toxicity of nanomaterials are strongly dependent on several parameters. The identification of these determinants, which appear essential for a “safety-by-design” approach, will therefore require an in-depth characterization of the toxicological properties of each type of nanomaterial.

Con il termine “nanomateriali” si intendono materiali contenenti particelle in stato libero o aggregato delle quali almeno il 50% abbia dimensioni comprese tra 1 e 100 nm. Il grande sviluppo delle nanotecnologie ha immesso sul mercato nanomateriali di vario genere in diversi settori produttivi (alimentare, chimico, farmaceutico) ed in numero sempre crescente. Per questo motivo, diversi studi si pongono come obiettivo la caratterizzazione delle proprietà chimico-fisiche dei nanomateriali e la determinazione dei loro effetti sull’ambiente e sulla salute umana. Esempi di nanomateriali ampiamente usati in campo industriale sono i nanotubi di carbonio a parete multipla (MWCNT) e nanoparticelle di silice amorfa (ASNP). Lo scopo di questa tesi è quello di chiarire i potenziali rischi degli MWCNT ed ASNP, valutando la loro interazione con determinati modelli cellulari. In particolare, l’attenzione è stata focalizzata sulla valutazione dei potenziali effetti tossici su cellule dell’immunità innata e sull’identificazione dei determinanti strutturali di tossicità. Dal momento che l’inalazione è la maggiore via d’interazione con i nanomateriali, le prime cellule che interagiscono con queste particelle sono i macrofagi e le cellule dell’epitelio respiratorio. Per questo motivo, gli effetti biologici degli MWCNT ed ASNP sono stati studiati su tre linee cellulari, rappresentativi di questi tipi cellulari: i macrofagi MH-S e RAW264.7 e le cellule epiteliali bronchiali Calu-3. La prima parte della tesi è incentrata sull’identificazione dei determinanti strutturali di tossicità, in vitro, di quattro preparazioni di MWCNT (NM400, NM401, NM402 e MWCNT-SA) che differiscono per lunghezza, morfologia (rigida, needle-like o flessibile, tangle-like) e livelli di contaminanti metallici. Abbiamo valutato gli effetti biologici degli MWCNT sui macrofagi e cellule epiteliali, allo scopo di identificare i determinanti di tossicità ancora non completamente chiariti. Per studiare gli effetti biologici sui macrofagi, sono stati valutati i seguenti endpoints: vitalità cellulare, funzionalità macrofagica ed attivazione macrofagica di tipo classico (M1). Nel complesso i risultati ottenuti mostrano che, i principali determinanti di tossicità per i macrofagi, sono la lunghezza e la conformazione needle-like, la quale ostacola o addirittura impedisce la fagocitosi. Infatti, la maggiore tossicità di NM401 e degli MWCNT-SA, come dimostrato dalla diminuzione di vitalità cellulare e dall’alterazione dell’attività funzionale dei macrofagi, è riconducibile alla loro maggiore lunghezza e alla loro morfologia. Al contrario, la lunghezza ridotta e la conformazione tangle-like (NM400 e NM402) promuovono l’attivazione macrofagica M1. Dal momento che questi materiali sono fagocitabili dai macrofagi, questi risultati suggeriscono che la fagocitosi rappresenta il principale step per l’attivazione macrofagica di tipo M1, per i materiali con bassa tossicità. In seguito abbiamo verificato se gli MWCNT producessero un’alterazione della barriera epiteliale, in quanto è ben noto in letteratura che questi tendono ad aggregare e in tale forma persistere sulla parete dell’epitelio respiratorio. Il comportamento delle cellule epiteliali è stato studiato sia a livello di monostrato (popolazione cellulare) che a livello della singola cellula. A livello di popolazione cellulare, la resistenza elettrica trans-epiteliale (TEER) è stata usata come indicatore delle competenze di barriera; l’attività caspasica è stata misurata con un saggio biochimico e la vitalità cellulare è stata misurata sia con un saggio biochimico sia con tecniche di alta risoluzione (HTP), basate sulla microscopia automatizzata a epifluorescenza. A livello della singola cellula, gli effetti biologici degli MWCNT sono stati studiati utilizzando la microscopia confocale valutando la morte cellulare (calceina/propidio), la proliferazione (Ki-67), l’innesco di fenomeni infiammatori (NF-κB) e l’apoptosi ( attività caspasica). I nostri dati mostrano che il principale determinante di tossicità per le cellule epiteliali dipende dalla conformazione con la quale gli MWCNT entrano in contatto con le cellule, in particolare, se gli MWCNT formano aggregati. La seconda parte della tesi è incentrata sull’identificazione dei determinanti strutturali di tossicità di due preparazioni di ASNP ( materiali con modesta tossicità). Questo studio, ha valutato la capacità delle ASNP, con dimensioni ed area di superficie simili ma prodotti tramite processi diversi, (colloidale NM200 vs. pirogenica NM203), di indurre attivazione macrofagica nelle linee cellulari MH-S e RAW264.7. Per studiare gli effetti biologici di queste due preparazioni sono stati valutati i seguenti endpoints: vitalità cellulare, lo stress ossidativo (produzione di ROS e induzione di Hmox-1), l’induzione dell’ossido nitrico sintetasi (Nos2), la produzione di ossido nitrico (NO), la secrezione delle citochine TNF-α, IL-6 e IL-1β. Il microscopio confocale e quello ad elio (HIM) sono stati utilizzati per studiare l’interazione tra ASNP e superficie cellulare. I risultati dimostrano che le ASNP pirogeniche sono molto più inflammogeniche delle colloidali. Inoltre, è stato proposto un altro meccanismo di tossicità, che consiste nella maggiore capacità delle ASNP pirogeniche di legare composti biologicamente attivi, come l’LPS, aumentandone i loro effetti. Per questo motivo, il principale determinante di tossicità delle ASNP, è il procedimento al alta temperatura con la quale vengono prodotte le ASNP pirogeniche. In conclusione, questa tesi evidenzia che i determinati di tossicità dei nanomateriali sono fortemente dipendenti da diversi parametri. L’identificazione di questi determinanti, che appare essenziale per il cosidetto “safety-by-design approch”, richiede, quindi, una profonda caratterizzazione delle proprietà tossicologiche di ogni tipo di nanomateriale.