Ligandi dei siti recettoriali orto- e allosterici: caratterizzazione in vitro e in vivo di nuovi derivati dualsterici bisammonioalcanici

Abstract

In questo studio sono stati caratterizzati in vitro e in vivo tre diverse serie di composti dualsterici sintetizzati come agonisti muscarinici preferenziali per il sottotipo recettoriale M2. Questi ibridi sono caratterizzati dalla capacità di interagire contemporaneamente con il sito di legame del ligando endogeno, definito ortosterico, e con il sito allosterico. Sono infatti ottenuti dalla fusione di potenti agonisti muscarinici ortosterici con modulatori allosterici. Il vantaggio di avere molecole preferenziali per il sottotipo M2 potrebbe avere un risvolto terapeutico importante nell’ambito del trattamento del dolore. Infatti, nonostante i progressi fatti nella comprensione della fisiopatologia del dolore, la terapia farmacologica delle sintomatologie dolorose è spesso inadeguata. Gli approcci per sviluppare nuove molecole o individuare nuovi possibili bersagli terapeutici sono in continua evoluzione. Nell’ambito della ricerca di nuovi target un ruolo importante hanno i recettori muscarinici; infatti è noto da tempo il coinvolgimento di questi recettori, in particolare del sottotipo M2, nel mediare analgesia. La difficoltà nello sviluppo di agonisti muscarinici come analgesici risiede però nella difficile capacità di discriminare tra i diversi sottotipi recettoriali, data l’elevata omologia del sito di legame ortosterico tra le sottopopolazioni della famiglia dei recettori muscarinici. Questo comporta l’insorgenza di pesanti effetti avversi dovuti ad esempio a stimolazione M3. La capacità dei ligandi dualsterici di interagire contemporaneamente anche con il sito allosterico, molto meno conservato tra i diversi sottotipi, potrebbe conferire una preferenzialità per il sottotipo M2. In questa ottica si potrebbe disporre di agenti dotati di proprietà analgesiche, ma accompagnati da una ridotta incidenza di effetti avversi. Tramite studi funzionali in vitro sono state quindi determinate potenza ed efficacia nei confronti di tre sottotipi recettoriali muscarinici, M1, M2, M3, nonché l’attività anticolinesterasica dei derivati in studio. L’attività analgesica dei composti è stata invece valutata in vivo tramite Writhing test e Hot plate test; inoltre è stata monitorata la comparsa di effetti sedativi, in grado di alterare o interferire con le risposte ottenute dai test di analgesia, così come dei principali effetti avversi centrali e periferici dovuti a stimolazione muscarinica. Le prime due serie di ibridi in studio hanno rivelato in vitro un comportamento da potenti agonisti nei confronti del recettore M2, con valori di potenza e attività intrinseca leggermente più bassi per i sottotipi M1 e M3; invece i composti dell’ultima serie hanno mostrato solo un debole agonismo verso i recettori muscarinici, ed una capacità di stimolare i recettori M2 trascurabile. Tuttavia in vivo tutte le serie hanno mostrato un’azione analgesica dose-dipendente nel Writhing test. Sebbene gli ibridi abbiano mostrato un profilo di tollerabilità migliore rispetto ai propri progenitori ortosterici, solo pochi derivati hanno meritato un ulteriore approfondimento dell’attività analgesica. In particolare si è evidenziato il composto 8b, agonista bitopico M2, dotato di rilevanti proprietà analgesiche e buon profilo di tollerabilità, suggerendo che la strategia di sintetizzare ligandi dualsterici sembra essere un approccio valido e innovativo per lo sviluppo di agenti che possano rappresentare un’alternativa nell’ambito della terapia del dolore. Infine, dallo studio dell’ultimo gruppo di derivati sono emersi risultati inaspettati, che hanno portato all’identificazione di composti dotati di proprietà analgesiche indipendenti dalla stimolazione muscarinica, il cui meccanismo d’azione necessita pertanto di ulteriori indagini.

In this study we characterized in vitro and in vivo three different groups of dualsteric compounds, which were synthesized as M2 muscarinic agonists. These bitopic ligands, which incorporate in a unique molecule an orthosteric muscarinic agonist and a molecular fragment of different allosteric modulators, are expected to bind simultaneously to the orthosteric and the allosteric sites present in the M2 receptor discriminating this receptor subtype with respect to the other muscarinic receptors. The interest in these molecules derives from the hypothesis that compounds which display M2 subtype preference could be a promising strategy to develop novel analgesic agents as an improved approach alternative to the current pain therapy, today still inadequate because of the development of dependence and untoward effects or, sometimes, poorly effective. Indeed, by taking advantage of the structural heterogeneity between the allosteric sites of muscarinic receptors, dualsteric ligand could display M2 subtype preference to reach analgesic properties without relevant cholinergic side effects. The first two groups of hybrids here studied behaved as potent M2 full agonists endowed with slightly lower potency and intrinsic activity against M1 and M3 subtypes when studied in proper isolated organ preparations; instead the last group of compounds showed only weak muscarinic agonism and negligible ability to activate M2 receptors. In vivo, almost all the compounds showed dose-dependent analgesic effects in Writhing test but, nevertheless an improved tolerability profile compared with the respective orthosteric progenitor, only few agents deserved a deeper investigation on their effective analgesic activity. The final result was the identification of a selective M2 muscarinic bitopic agonist, 8b, with a remarkable and safe antinociceptive property that provides support to the strategy to generate dualsteric ligands as advantageous tools opening promising avenues toward novel pain therapy. Lastly, an exciting unexpected result arising from this research is the identification of analgesic compounds endowed with a multiple but muscarinic-independent mechanism of action whose pharmacology remains to be further investigated.