Epidemiologia molecolare di rotavirus: studio della variabilità genetica e dei meccanismi evolutivi

Abstract

Nell'uomo l'infezione da rotavirus (RV) è considerata la principale causa di gastroenterite nei primi anni di vita, si stima che l’infezioni causi circa 450.000 morti l’anno soprattutto nei paesi in via di sviluppo. I RV, appartenenti alla famiglia Reoviridae, sono virus privi di pericapside con un diametro di circa 70 nm, dotati di un capside trilaminare, al cui interno sono racchiusi 11 segmenti di RNA bicatenario. Due segmenti virali codificano per le proteine esterne del capside, denominate VP7 e VP4, che sono alla base della nomenclatura binomiale adottata per la loro classificazione genetica. A oggi sono stati identificati 37 G-tipi (VP7) e 27 P-tipi (VP4), ma solo 6 G/P combinazioni genetiche contribuiscono in modo considerevole alla patologia di RV nella popolazione mondiale (G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8] e G12P[8]). L’elevata variabilità di RV è causata da fenomeni di riassortimento genico, accumulo di mutazioni puntiformi e riarrangiamento genetico. Attualmente, due vaccini orali contro RV RotarixTM (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Belgium) e RotaTeqTM (Merk & Co., Inc., Whitehouse Station, USA) sono in commercio in numerosi Paesi del mondo. Limitate sono le conoscenze sulle correlazioni molecolari tra la circolazione dei ceppi di RV in questi ultimi anni e quelli vaccinali. Pertanto la caratterizzazione molecolare dei ceppi circolanti di RV è essenziale per svelare il loro make-up genetico, monitorare la comparsa di nuovi ceppi e aumentare le conoscenze sui meccanismi evolutivi. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di approfondire lo studio delle dinamiche evolutive di RV attraverso la caratterizzazione molecolare dei ceppi circolanti nell’area di Parma e comprendere le dinamiche epidemiologiche di questi virus. Sono stati caratterizzati geneticamente le sequenze VP4 e VP7 di 445 RV rivelati nell’ambito delle indagini condotte su 3045 bambini con gastroenterite afferenti dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma nel periodo gennaio 2008-dicembre 2012 (prevalenza d’infezione da RV: 14,61%). La prevalenza annuale di infezione da RV è variata dal 15,84% nel 2010 al 11,63% nel 2012. Solitamente ogni anno numerosi ceppi circolano in una determinata area e di anno in anno alcuni ceppi prevalgono su altri. Tra questi G1P[8] resta quello maggiormente diffuso sia nei paesi industrializzati che in quelli in via di sviluppo. Anche a Parma nel periodo di sorveglianza il genotipo maggiormente frequente è stato G1P[8] con una prevalenza del 65,61% (292/445) confermando quanto già osservato in studi di sorveglianza precedenti condotti nella stessa area e in genere negli ultimi decenni a livello mondiale. Oltre G1P[8] i genotipi di RV maggiormente circolanti sono stati G4P[8] nel 8,74% (39 casi), G3P[8] nel 4,26% (19 casi), G2P[4] nel 4,04% (18 casi) e G9P[8] nel 2,47% (11 casi). Inoltre sporadicamente hanno circolato ceppi con combinazioni rare: G1P[4] nel 0,44% (2 casi) e ceppi G3P[4], G3P[6], G6P[9] nello 0,22% ciascuno (1 caso) e combinazioni di derivazione bovina: G10P[14] e G8P[14] nello 0,22% ciascuno (1 caso). La predominanza del genotipi G1P[8] è stata particolarmente significativa negli anni 2010 (71,1%) e 2011 (96,4%). L’analisi filogenetica condotta su una selezione di ceppi G1P[8] non ha dimostrato particolari differenze nella segregazione delle sequenze nucleotidiche. Tuttavia l’analisi delle sequenze aminoacidiche dedotte ha dimostrato diverse sostituzioni nei ceppi circolanti in quel periodo non presenti nei ceppi circolanti in anni precedenti. Pertanto è possibile ipotizzare che tali sostituzione possano aver contribuito alla maggiore prevalenza di questo genotipo in quegli anni. La sorveglianza dei genotipi di RV ha dimostrato anche che il genotipo G4P[8], sebbene subisca marcate fluttuazioni di prevalenza nel corso degli anni, è tra i più frequenti dopo G1P[8] e G3P[8]. L’analisi filogenetica condotta sui geni VP7 e VP4 di ceppi G4P[8] di RV rivelati in 2 periodi distinti di sorveglianza (2004-2005 e 2008-2012), ha dimostrato che nonostante i numerosi lignaggi fin ora descritti in letteratura i ceppi G4P[8] circolanti nell’area di Parma hanno mantenuto per quasi un decennio l’assetto G4-Ic e P[8]-III e che le relative sequenze segregavano negli alberi filogenetici con un profilo temporale di evoluzione. Messe a confronto con il ceppo prototipo G4, le sequenze aminoacidiche di VP7 dei ceppi G4P[8] di Parma hanno mostrato la presenza di una inserzione e diverse sostituzioni aminoacidiche confermando i ritrovamenti avvenuti in altri Paesi. Anche il confronto delle sequenze aminoacidiche nella regione ipervariabile VP8* di VP4 a confronto con il ceppo di riferimento della specificità P[8]-III ha mostrato diverse sostituzioni. La progressiva variazione di VP7 e VP4 è in accordo con il potere evolutivo di RV basato sull’accumulo di mutazioni puntiformi. Differenze intra-genotipiche sostanziali sono state riscontrate anche nei siti putativi di neutralizzazione tra i ceppi di Parma e i ceppi vaccinali. Pertanto, soltanto la continua sorveglianza dei genotipi di RV permetterà di monitorare la comparsa di nuovi ceppi e/o lignaggi genetici e verificare la significatività delle mutazioni osservate. Inoltre, alla luce delle limitate informazioni sulla variabilità genetiche di VP4, in questo studio è stato verificato se la continua predominanza dei RV con specificità P[8] e se le fluttuazioni delle prevalenze dei ceppi con questa specificità in combinazione con diverse specificità G (G1, G3, G4, G9) potessero dipendere da possibili variazioni genetiche sul gene VP4. A tale scopo è stata condotta un’analisi filodinamica sulla sequenza VP4 di ceppi circolanti dal 1987 al 2012 che ha dimostrato che tutti erano di lignaggio P[8]-III, nell’ambito del quale erano suddivisi in molteplici sublignaggi. In particolare si distinguevano sublignaggi associati a sequenze con discreta variabilità genetica appartenenti a ceppi circolanti negli anni contraddistinti da una maggior prevalenza e sublignaggi comprendenti sequenze con una più alta omologia nucleotidica, appartenenti a ceppi circolanti negli anni contraddistinti da una minor prevalenza, confermando che la circolazione di questi ceppi correla con cambiamenti della sequenza VP4 di lignaggio P[8]-III. Infine, il ritrovamento di un tasso di mutazione di 3,04 x 103 (mutazioni/sito/anno) sottolinea l’elevata variabilità genetica di questo virus al pari di altri virus a RNA. Altro dato degno di nota è stata la caratterizzazione molecolare di un ceppo di RV,l’unico agente infettivo ritrovato nelle feci e nel liquor di una bambina con gastroenterite associata a meningismo e mai decritta prima in Italia. Il ceppo è risultato appartenere al genotipo G1P[8] e ha mostrato sostituzioni aminoacidiche all’interno del sito di legame della proteina NSP4, all’interno della regione ipervariabile della proteina VP4, nota contenere gli epitopi antigenici, a livello del dominio di dimerizzazione e del dominio di legame del fattore eucariotico di inizio della traduzione della proteina NSP3, nota essere responsabile della diffusione extraintestinale. È verosimile ipotizzare che tali mutazioni possano aver influenzato la conformazione e/o l’attività di tali proteine modificando la patogenicità del ceppo e permettendone la diffusione dall’intestino al SNC. In conclusione, la realizzazione di questo studio ha permesso di ottenere un quadro epidemiologico-molecolare significativo e aggiornato dei ceppi di RV circolanti nell’area di Parma in un periodo relativamente lungo. Sebbene in Italia i dati di copertura del vaccino non siano ancora disponibili, la continua sorveglianza delle infezioni da RV ha permesso di dimostrare nell’area di Parma una rilevante riduzione (circa del 30%) della prevalenza di infezione da RV dopo l’introduzione in commercio dei vaccini nel 2006, passando da 34,5% nel 2005 all’11,6% nel 2012. Soltanto la continua sorveglianza dei genotipi di RV permetterà di verificare l’efficacia dei vaccini e monitorare l’eventuale emergenza di certi genotipi e/o la comparsa di nuovi ceppi e/o lignaggi genetici. Inoltre questo studio ha messo in luce che le conoscenze dell’aspetto genetico dei RV sono indispensabili per comprendere i meccanismi evolutivi responsabili dei vantaggi selettivi che taluni genotipi possono acquisire.