L’inibizione di MEK potenzia l’effetto antitumorale del Triossido di Arsenico in cellule di Leucemia Mieloide Cronica Bcr-abl+ resistenti all’Imatinib: studio preclinico in vitro ed in vivo.

Abstract

La Leucemia Mieloide Cronica (LMC) è una malattia caratterizzata dalla presenza di una specifica anormalità cromosomica, il cromosoma Philadelphia, codificante per una proteina di fusione di peso molecolare 210 Kd (p210) chiamata Bcr-Abl, che è una tirosin-chinasi sempre attiva. Il farmaco d’elezione per il trattamento di questa patologia è il tirosin-chinasi inibitore (TKI) Imatinib (Gleevec) che riduce l'attività di Bcr-Abl. L’utilizzo dell’Imatinib in clinica è però limitato dall’insorgenza di resistenza a questo farmaco, sia dovuta all’iperespressione di Bcr-Abl sia per la presenza di mutazioni del gene BCR-ABL che interferiscono con il legame dell’Imatinib. Altri TKIs sono stati sviluppati per il trattamento di questi pazienti, come il Dasatinib e il Nilotinib. Entrambi i farmaci hanno mostrato efficacia nei pazienti resistenti a Imatinib e sono attivi verso la maggior parte delle mutazioni di Bcr-Abl, esclusa la mutazione T315I completamente resistente a Imatinib, Dasatinib e Nilotinib. È per questo che si stanno sviluppando nuove strategie terapeutiche per il trattamento dei pazienti portatori di questa mutazione. In questo studio si è testata l’efficacia della combinazione con inibitori di MEK (PD184352 e PD0325901) associati all’Arsenico Triossido (ATO) in linee cellulari di LMC con diverse alterazioni di Bcr-Abl tra cui la mutazione T315I. Abbiamo dimostrato che il trattamento con PD aumentava significativamente la citotossicità indotta dall’ATO in tutte le linee cellulari testate di LMC e che l’interazione dei due farmaci era di tipo sinergico nell’induzione dell’apoptosi nella maggior parte delle linee analizzate, compresa quella portatrice della mutazione T315I. Dallo studio delle proteine mediante western blot abbiamo poi osservato che nelle linee analizzate il trattamento con PD inibiva l’up-regolazione ATO-indotta dell’oncoproteina Bcr-Abl, bloccandone l’attività chinasica, dato confermato anche dall’inibizione della fosforilazione/attivazione della proteina CrkL, substrato riconosciuto di Bcr-Abl. Abbiamo inoltre dimostrato che uno dei target molecolari della combinazione PD+ATO è la pathway mediata dalla p73. Infatti il trattamento combinato PD+ATO promuoveva un accumulo dell’isoforma proapoptotica e antiproliferativa TAp73 (PD-mediato) e una riduzione dei livelli dell’isoforma antiapoptotica e proproliferativa ΔNp73 (ATO-mediata). Dato che la modulazione del bilanciamento di queste due proteine a favore dell’isoforma proapoptotica TAp73 può contribuire alla suscettibilità delle cellule tumorali alla risposta verso chemioterapici, abbiamo calcolato la ratio TAp73/ΔNp73 e abbiamo così osservato che nelle linee analizzate il trattamento combinato PD+ATO portava ad un rilevante aumento del rapporto TAp73:ΔNp73 rispetto ai singoli trattamenti, di circa 3 volte rispetto al PD e 1.5 volte rispetto all’ATO. Lo sbilanciamento dell’equilibrio TAp73:ΔNp73 a favore dell’isoforma TAp73 indotto dal trattamento combinato si è quindi tradotto in un aumento dell’espressione del gene target di p73 p53AIP1 (p53-regulated apoptosis-inducing protein 1) e della perdita del potenziale di membrana mitocondriale. Al fine di confermare la rilevanza biologica delle isoforme della p73 in risposta al trattamento combinato PD+ATO abbiamo inibito l’espressione endogena di TAp73 e ΔNp73 mediante trasfezione con specifici siRNA (small interfering RNA), ed abbiamo osservato che il knock-out di TAp73 riduceva significativamente l’apoptosi indotta dal trattamento combinato PD+ATO, mentre il silenziamento della ΔNp73 portava ad un significativo potenziamento dell’effetto citotossico di PD+ATO, confermando il ruolo chiave di queste proteine nell’attivazione dell’apoptosi indotta dal trattamento combinato. In seguito abbiamo studiato l’efficacia della combianzione PD+ATO in un modello leucemico murino clinicamente rilevante imatinib-resistente Bcr-Abl dipendente. Topi NOD/SCID (non-obese diabetic/severe comined immunodeficient) inoculati con la linea cellulare portatrice della mutazione T315I sviluppavano una leucemia Imatinib-resistente che portava a morte dell’animale in circa 30 giorni. Dall’analisi istopatologica, immunoistochimica e molecolare effettuata a fine trattamento, fegati e milze dei topi trattati con Imatinib presentavano abbondanti infiltrazioni neoplastiche che confermavano anche la loro aumentata dimensione e peso. Al contrario, i fegati e le milze dei topi trattati con PD+ATO mostravano la loro normale dimensione e un basso grado di infiltrazioni neoplastiche, indice di una forte inibizione della progressione della malattia. Questi dati correlavano strettamente con un significativo aumento della sopravvivenza dei topi trattati con la combinazione PD+ATO rispetto al trattamento con Imatinib. Questi dati preclinici in vitro ed in vivo dimostrano l’efficacia di questa combinazione su linee cellulari bcr-abl+ Imatinib-resistenti, suggerendo che questo trattamento combinato potrebbe costituire una valida strategia terapeutica per la cura di pazienti portatori della LMC T315I+.

Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease characterized by the presence of the Philadelphia chromosome, which generates the constitutively active kinase Bcr-Abl of 210 Kd (p210). Imatinib (Gleevec) is a small molecule tyrosine kinase inhibitor (TKI) that effectively targets the Bcr-Abl kinase. Imatinib mediates remission in the majority of patients with CML, but patients can develop resistance most frequently through Bcr-Abl overexpression or acquired point mutations in the kinase domain of Bcr-Abl that block Imatinib binding to Bcr-Abl. In most patients, resistance against Imatinib occurs from Bcr-Abl point mutations. Second-generation TKIs, such as Nilotinib and Dasatinib, have shown efficacy in the treatment of patients with many of the Bcr-Abl mutations, except for T315I mutation, completely resistant to second-generation TKIs. Thus novel therapeutic strategies are needed to address the emerging problem of Imatinib resistance. The aim of this study was to investigate whether the combined treatment with highly selective inhibitors of MEK phosphorylation (PD 184352 or PD0325901) and arsenic trioxide (ATO) has cytotoxic effects on cell lines expressing various Bcr-Abl alterations, including T315I mutation. We found that treatment with PD strongly enhanced the cytotoxic effect of ATO in all tested CML cell lines, and combined treatment with PD plus ATO resulted in the synergistic induction of apoptosis in the majority of cell lines tested, including T315I+ cell line. Immunoblotting analyses demonstrated that treatment with PD inhibited the ATO-mediated up-regulation of Bcr-Abl and CrkL activation, a recognised substrate of Bcr-Abl. Therefore, we studied whether the p53-related gene p73 is molecular target of the combined treatment in T315I+ cells. We found that the combination PD+ATO promoted the accumulation of the proapoptotic and antiproliferative TAp73 protein (PD-mediated) and reduced the levels of the antiapoptotic and proproliferative dominant-negative ΔNp73 protein (ATO-mediated) thus elevating TA/ΔNp73 ratio that was significantly higher than either treatment alone (3 fold increase respect to PD and 1.5-fold increase respect to ATO). Consistent with these results, we found that PD+ATO increased expression of p73 target gene p53AIP1(p53-regulated apoptosis-inducing protein 1) and loss of mitochondrial depolarization. To determine the biologic relevance of p73 family proteins in response to PD+ATO treatment, we silenced the expression of endogenous TAp73 and ΔNp73 transcripts by using specific siRNA. We found that the selective down-regulation of TAp73 strongly decreased the PD+ATO induced-apoptosis, whereas functional knock-out of ΔNp73 significantly enhanced PD+ATO cytotoxicity, thereby confirming the key role of these proteins in PD+ATO-induced apoptosis. Finally, we studied PD+ATO combination in a clinically relevant mouse model of Imatinib-resistant BCR-ABL-dependent disease. Non-obese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice were injected intravenously with Bcr-Abl-T315I-expressing cell line. Mice with Bcr-Abl-T315I-induced Imatinib resistant leukemia developed aggressive disease, typically resulting in death in 30 days. Histopathological, immunohistochemical and molecular analysis of 20 days Imatinib-treated mice revealed massive infiltration and increased size of liver and spleen. In contrast, spleens and livers from PD+ATO-treated mice demonstrated substantially normal tissue architecture. Moreover PD+ATO-treated mice showed significantly prolonged survival compared to Imatinib, confirming the PD+ATO-triggered inhibition of leukemic progression. Our preclinical in vitro and in vivo studies suggest that PD+ATO-treatment could represent an effective therapeutic strategy for the treatment of Imatinib-resistant Bcr-Abl+ leukemia, including those harbouring the T315I mutation.