Development of new Rac1 inhibitors as potential pharmacological agents for the treatment of cardiovascular diseases: from identification to in vivo study

Abstract

Osservazioni sperimentali e cliniche hanno documentato il ruolo della proteina G monomerica Rac1 in numerosi eventi coinvolti nelle patologie cardiovascolari. L'obiettivo di questo studio è stato quello di identificare nuove classi d’inibitori di Rac1 come strumento farmacologico per studiare il ruolo di questa proteina in tali patologie. Partendo da un nostro precedente lavoro in cui erano state identificate 5 nuove classi di inibitori di Rac1, mediante un approccio computazionale, sono state selezionate 57 nuove entità chimiche caratterizzate da un nucleo 3-aril-1H-pirazol-5-carboxamide la cui capacità d’ inibire l’attività di Rac1 è stata valutata mediante saggio G-LISA. I composti 3, 4, 5, 11 e 21 sono risultati essere i più potenti nell’ inibire selettivamente l’attivazione di Rac (IC50 =4.4-29.1μM). Un’ altra metodica per andare ad identificare nuovi inibitori di Rac1 ha previsto il disegno di nuove entità chimiche partendo da un precedente modello 3D che descrive il complesso tra la proteina Rac e il composto NSC23766, primo inibitore di Rac descritto in letteratura. Da questo studio, una serie di derivati basati su uno scaffold 2-ammino-3-(phenylsulfanyl) norbornano-2-carbossilato sono stati sintetizzati per le prove farmacologiche. Tali composti, in particolare il composto 13, sono caratterizati da una maggior potenza ed efficacia nell’inibire l’attività di Rac1 con una IC50 di 2,5 μM e una riduzione del 75% dei livelli intracellulari Rac-GTP. Inoltre, questi composti hanno dimostrato di essere selettivi per Rac senza influenzare l'attività di RhoA, proteina omologa di Rac. Da questa prima parte dello studio in cui sono stati identificati nuovi inibitori di Rac il composto 4 è risultato il miglior candidato in quanto possiede una buona IC50=8,7μM e caratterizzato da una buona curva dose-risposta e selettivà. In cellule muscolari lisce (CML) trasfettate con plasmidi che esprimono 3 tipi di GEF quali Tiam1, TrioN, e VAV2 costitutivamente attivi, trattate con il composto 4, si è osservata una riduzione dei livelli di Rac-GTP. Inoltre il composto 4 ha inibito la produzione di specie superossido dell’ossigeno in monociti umani freschi (IC50=1nM), questo aspetto indica come, inibendo Rac, si abbia una potente attività antiossidante. Il composto 4 ha inoltre inibito la migrazione di CML stimolate con PDGF-BB (IC50=5,8 μM). In studi di farmacocinetica e farmacodinamica del composto 4 in topi C57BL/6 al dosaggio di 50 e 100 mg/kg al giorno si è osservata una Cmax di 925 ng/ml dopo 1h dall’ultima somministrazione i.p. del composto al dosaggio di 50 mg/Kg al giorno con una riduzione del 35% dei livelli di Rac1-GTP in omogenati cardiaci, mentre al dosaggio di 100mg/kg al giorno si è osservata una Cmax di 2050 ng/ml dopo 3h con una riduzione del 98%. In questo studio abbiamo quindi identificato un nuovo inibitore selettivo di Rac in grado di interferire con la migrazione cellulare e mostrando attività antiossidante, evento chiave per lo sviluppo d’ipertrofia cardiaca. In futuro, queste classi di composti saranno testate nel modello d’ipertrofia cardiaca caratterizzato nel presente lavoro per valutare il ruolo di Rac1 in questa patologia.

Experimental and clinical observations have documented the role of the monomeric G protein Rac1 in a number of events involved in cardiovascular diseases . The aim of this study was to identify new classes of Rac1 inhibitors as pharmacological tool to study the role of this protein in these pathologies . Starting from our previous work in which they were identified 5 new classes of inhibitors of Rac , via a computational approach, have been selected 57 new chemical entities characterized by a core 3-aryl-1H-pyrazol-5-carboxamide whose capacity to inhibit the activity of Rac was assessed by G- LISA assay . The compounds 3, 4 , 5, 11 and 21 were found to be the most powerful to selectively inhibit the activation of Rac1 (IC50 = 4.4 - 29.1μM ) . Another approach used to identify new inhibitors of Rac was attempt a computer aided de-novo design of a new scaffold, starting from the previously described 3D model of the complex between Rac and NSC23766, first inhibitor of Rac described . From this study, a series of derivatives based on a scaffold 2-amino- 3-(phenylsulfanyl) norbornane -2- carboxylate were synthesized for the pharmacological tests . These compounds, in particular compound 13, are characterized by a higher power and efficiency in the inhibit Rac activity with an IC50 of 2.5 μM and a 75% reduction in intracellular Rac–GTP levels. Furthermore, these compounds have proven to be selective for Rac without affect the RhoA activity, homologous of Rac From this part of the study compound 4 resulted the best candidate for its good IC50 (8,7 μM), and characterized by a good dose-response curve and selectivity. In smooth muscle cells (SMC) transfected with plasmids that express three types of GEF such as Tiam1, Trion, and VAV2 constitutively active, treated with compound 4 was observed a reduction in the Rac-GTP levels. In addition, compound 4 inhibited the production of superoxide oxygen species in fresh human monocytes (IC50 = 1nM ) , this aspect indicates how inhibiting Rac , we obtain a powerful antioxidant activity. The compound 4 has also inhibited the migration of CML stimulated with PDGF -BB (IC50= 5.8 uM) . In studies of the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the compound 4 in C57BL / 6 mice at a dose of 50 and 100 mg/kg/day was observed Cmax of 925 ng / ml after 1 hour post-dosing ip of the compound at a dosage of 50 mg/kg/day with a 35% reduction of Rac–GTP levels in cardiac homogenates , while at a dose of 100mg/kg/day we observed a Cmax of 2050 ng / ml after 3h with a 98% reduction. In this study we have therefore identified a novel selective inhibitor of Rac that interfere with cell migration and showing antioxidant activity , a key event in the development of cardiac hypertrophy. In the future, these classes of compounds will be tested in the cardiac hypertrophy model characterized in the present work in order to establish the role of Rac in this disease.