Effetti sinergici ed antagonisti dei modulatori della risposta stringente ppGpp e DksA sulla struttura del complesso di inizio della trascrizione batterica

Abstract

In condizioni favorevoli alla crescita ed alla proliferazione i batteri utilizzano buona parte delle risorse energetiche per la sintesi proteica. Tuttavia, l’adattamento a situazioni ambientali non ottimali è stato garantito dall’evoluzione di meccanismi che permettono un rapido cambiamento del profilo di espressione genica, rendendoli capaci di indirizzare le scarse risorse disponibili verso nuove esigenze metaboliche. In E. coli e nella maggior parte dei procarioti questo fenomeno prende il nome di “risposta stringente” ed è mediato da due modulatori che agiscono direttamente sull’RNA polimerasi (RNAP): l’alarmone ppGpp e la proteina DksA. Mentre la DksA è sempre presente nelle cellule ad una concentrazione costante, la concentrazione intracellulare di ppGpp dipende dalle condizioni ambientali, venendo prodotto ad elevati livelli solo in condizioni di stress. Inoltre, in base al principio secondo il quale l’attivazione della risposta stringente è indicativa delle condizioni metaboliche della cellula ospite, alcuni batteriofagi temperati, tra cui il batteriofago lambda, hanno evoluto meccanismi di regolazione dell’espressione genica legati alla scelta lisi-lisogenia mediati dal ppGpp e dalla DksA. In letteratura sono riportate numerose evidenze a supporto dell’ipotesi secondo cui ppGpp e DksA agiscono influenzando la cinetica di formazione del complesso aperto; tuttavia, rimangono ancora da chiarire i dettagli strutturali alla base di tale effetto. Allo scopo di investigare le modificazioni conformazionali dell’RNAP associate al legame degli effettori della risposta stringente, in questo lavoro di tesi è stata impiegata la microscopia a forza atomica per effettuare un’approfondita analisi conformazionale dei complessi di inizio della trascrizione, valutando in particolare l’estensione dell’interazione tra l’RNAP e le sequenze upstream di diversi promotori (wrapping del DNA). Sono stati presi in considerazione due dei sette promotori che controllano la sintesi degli rRNA in E. coli, rrnB P1 e rrnA P1, ed il promotore PR del batteriofago lambda, responsabile dell’attivazione del ciclo litico. La scelta di questi promotori è motivata da diversi fattori, tra cui il fatto che essi risultano fortemente regolati da ppGpp e DksA, che sono stati estensivamente caratterizzati sia in vivo che in vitro e che mostrano differenze significative nella stabilità del complesso aperto e nell’interazione tra RNAP e regioni upstream. L’analisi e l’interpretazione dei dati raccolti ha permesso di dimostrare che il ppGpp e la DksA, a concentrazioni saturanti, modificano l’affinità tra l’RNAP ed i promotori, anche se ciò dipende dallo specifico promotore considerato e dalla concentrazione dei nucleotidi iniziatori. Sui promotori rrnB P1 e rrnA P1 il ppGpp non influenza il wrapping del DNA che, al contrario, risulta significativamente ridotto dalla DksA, sia quando questa viene aggiunta da sola che quando viene aggiunta insieme all’alarmone. Inoltre, è stato osservato che l’aggiunta di un largo eccesso di nucleotidi iniziatori elimina l’effetto della DksA. Sul promotore PR il ppGpp provoca una riduzione significativa del wrapping del DNA, mentre la DksA non sembra avere effetti, ma mitiga l’effetto negativo dell’alarmone quando aggiunta contestualmente ad esso. Questi risultati supportano un modello secondo il quale il ppGpp riduce l’affinità tra RNAP e promotore legandosi all’interfaccia tra le subunità beta’ ed omega, riducendo la mobilità relativa tra le subunità beta e beta’ ed impedendo il corretto alloggiamento del DNA nel sito attivo dell’enzima con conseguente inibizione dell’isomerizzazione a complesso aperto. La DksA sembra invece interferire con il corretto posizionamento dei nucleotidi nel sito attivo dell’RNAP riducendo in questo modo la stabilità del complesso aperto, ma solo a livello di promotori che presentano un complesso aperto instabile, come per esempio i promotori rrn.

When the environmental conditions are suitable for growth and proliferation, bacterial cells exploit most of the metabolic energy for protein synthesis. However, the development of sensing systems allow them to quickly adapt to suboptimal conditions by changing their gene expression profile in order to divert the limited resources available to the new metabolic needs. In E. coli and in most of the other prokaryotics this adaptation mechanism is called “stringent response” and it is mediated by two modulators which bind RNA polymerase (RNAP): the guanosine-3’,5’-bispyrophosphate alarmone (ppGpp) and DksA protein. The ppGpp intracellular concentration depends on environmental conditions (the alarmone is produced at high levels only under stress conditions) while the DksA intracellular concentration remains constant. Moreover, exploiting that ppGpp level can be considered as a molecular signal of the host metabolic conditions, some temperate bacteriophages, such as the lambda phage, evolved mechanisms based on gene expression regulation mediated by ppGpp and DksA to pursue the lysogenic or lytic pathway. A considerable amount of data in the literature supports the idea that both ppGpp and DksA affect the equilibrium of the open complex formation, even though the structural mechanism through which this is achieved remains unknown. In order to reveal conformational changes associated with ppGpp and DksA binding to RNAP, atomic force microscopy (AFM) has been employed to image and analyze the structure of single open promoter complexes with particular attention to the extent of interaction between RNAP and upstream promoter region (DNA wrapping). The study has been carried out by using E. coli RNAP and DksA, the rrnB P1 and rrnA P1 responsible for rRNA synthesis in E. coli, and the phage lambda PR promoter, activated during the lytic pathway. These promoters have been chosen because they are strongly regulated by ppGpp and DksA, have been extensively studied both in vivo and in vitro, display a different stability of the open complex, and are characterized by an extended RNAP-DNA upstream interaction upon open promoter complex formation. The collected data show that, at saturating concentrations, ppGpp and DksA affect the promoter occupancy even though their effect depends on the type of promoter and on the concentration of the initiating nucleotides. At the rrnB P1 and rrnA P1 promoters, ppGpp does not affect DNA wrapping while DksA, alone or in combination with ppGpp, significantly reduces DNA wrapping. Interestingly, the addition of a large excess of initiation nucleotides abolishes the DksA effect. At the lambda PR promoter, ppGpp causes a significant reduction of the DNA wrapping while DksA does not affect DNA wrapping when added alone but it seems to mitigate the alarmone negative effects when added in combination with ppGpp. These results support a model in which ppGpp reduces RNAP-promoter affinity by binding to the interface between the beta’ and omega subunits which reduces the mobility between the beta and beta’ subunits thus affecting the accommodation of promoter DNA into the enzyme active site and inhibiting the isomerization to open complex. Conversely, DksA seems to interfere with the proper nucleotide positioning in the active site of RNAP, decreasing open complex stability but only at promoters with an intrinsically unstable open complexes, such as the rrn promoters.