Numero di cellule progenitrici endoteliali e lunghezza dei telomeri nei leucociti circolanti: nuovi marcatori precoci di rischio cardiovascolare

Abstract

Il numero di Cellule Progenitrici Endoteliali (EPCs) circolanti e la Lunghezza Telomerica Leucocitaria (LTL) sono considerati marcatori emergenti di rischio cardiovascolare (CV), in quanto ridotti in presenza di fattori di rischio e patologie CV. Non esistono, ad oggi, studi riguardanti il loro possibile ruolo quali marcatori di stratificazione precoce di rischio CV in una popolazione di soggetti giovani adulti sani. Obiettivi: Il progetto di ricerca si divide in due parti. STUDIO 1 Valutare il numero di EPCs in una popolazione di giovani adulti sani, in relazione alla presenza di fattori di rischio CV noti con particolare riferimento all’insulinoresistenza (IR). STUDIO 2 Valutare la LTL in giovani adulti sani, in relazione alla presenza di fattori di rischio CV, di aterosclerosi subclinica e di indice cumulativo di rischio CV. Materiali e metodi: E’ stato valutato il numero di EPCs circolanti in 122 soggetti adulti sani (73M/49F; età 37±8 anni), normotesi ed in assenza di alcuna terapia farmacologica. In tutti i soggetti sono state raccolte le principali variabili cliniche ed antropometriche. E’ stato effettuato un prelievo a digiuno per la determinazione di glicemia, insulinemia (IRI), profilo lipidico, uricemia, inibitore dell’attivatore del plasminogeno (PAI-1), proteina C reattiva ad alta sensibilità (hsPCR) ed emocromo. L’IR è stata definita in base ai valori di IRI a digiuno. E’ stato effettuato un esame ultrasonografico per la determinazione dello spessore medio intimale (IMT) che rileva l’ispessimento della parete dell’arteria carotidea, e quindi indice di aterosclerosi subclinica, e calcolato il Framingham Risk score (FRs), un indice cumulativo di rischio CV. Il numero di EPCs è stato valutato mediante tecnica citofluorimetrica misurando l’espressione di specifici antigeni di superficie (CD133, CD34, e KDR) nella popolazione linfomonocitaria. Si è proceduto dapprima alla ottimizzazione delle fasi del protocollo d'analisi (lisi dei globuli rossi, settaggio delle condizioni di analisi FACS). Per ogni soggetto sono stati allestiti due campioni: il primo marcato con gli Abs specifici per la valutazione del numero di EPCs il secondo marcato con immunoglobuline IgG1 aspecifiche (controllo negativo). All'interno della stessa popolazione, in un sottogruppo di 82 soggetti, è stata misurata anche la lunghezza dei telomeri in cellule mononucleate isolate da sangue periferico. E' stato dapprima estratto il DNA con metodica standard e quindi valutata la lunghezza dei telomeri tramite PCR quantitativa. Per normalizzare i campioni in contenuto di DNA è stato valutato in parallelo un gene presente in singola copia per ottenere una T/S ratio tra Ct telomerico e Ct del singolo gene ulteriormente normalizzato per la T/S ratio di un DNA controllo (standard interno). Risultati: STUDIO 1 Il numero di EPCs è risultato inversamente correlato con l’indice di massa corporea (rho=-0.18;p<0.05), circonferenza vita (-0.2;<0.05), pressione sistolica (-0.23;<0.01) e diastolica (-0.21;<0.05), uricemia (-0.24;<0.005), PAI-1 (-0.19;<0.05) ed IRI (-0.2;<0.05) e direttamente correlato con i valori di colesterolo HDL (0.18;<0.05). Il genere maschile è risultato indipendentemente associato ad un ridotto numero di EPCs rispetto alle altre covariate(p<0.05). Dividendo la popolazione in sottogruppi in base al genere e alla presenza di IR, il numero di EPCs risultava minore nei maschi insulinoresistenti rispetto ai maschi insulinosensibili (p<0.05), questa differenza non si evidenziava nel genere femminile. STUDIO 2 La LTL è risultata inversamente correlata con i valori di età (rho=-0.24; p<0.05), circonferenza vita (-0.29;<0.01), trigliceridi (-0.25;<0.05), PAI-1 (-0.28;=0.01), hsPCR (-0.23;<0.05), IMT (-0.24;<0.05) e FRs (-0.28;<0.01) e direttamente correlata con colesterolo HDL (0.35;=0.001) ed EPCs (0.26;<0.05). I valori di IMT, di colesterolo HDL ed il numero di EPCs, sono risultati indipendentemente correlati alla LTL (p<0.05). Conclusioni: STUDIO 1 Il ridotto numero di EPCs nei maschi potrebbe contribuire a spiegare il maggiore rischio CV nel genere maschile rispetto a quello femminile in premenopausa di pari età. Inoltre, il ridotto numero di EPCs nei maschi insulinoresistenti potrebbe rappresentare uno dei possibili meccanismi tramite cui la IR si accompagna ad un aumentato rischio CV nel genere maschile. STUDIO 2 I risultati suggeriscono che la LTL possa essere considerata un marcatore precoce di rischio CV e di aterosclerosi subclinica, anche in una popolazione di soggetti giovani adulti sani a basso rischio CV. La correlazione indipendente tra LTL e numero di EPCs e l’origine midollare comune di queste due popolazioni cellulari, suggerisce l’esistenza di una meccanismo fisiopatologico condiviso alla base di queste alterazioni implicate nello sviluppo e progressione della patologia CV. Numero di EPCs e LTL si confermano possibili marcatori di stratificazione precoce di rischio CV anche in soggetti giovani adulti sani, seppure ulteriori studi siano necessari per confermarne un ruolo prognostico.

Circulating Endothelial Progenitor cell (EPC) number and Leukocyte Telomere Length (LTL) are considered new markers of cardiovascular (CV) risk, since they are both reduced in the presence of CV risk factors and diseases. No studies are available to date investigating EPC number and LTL as early markers in the stratification of CV risk in a population of healthy young adults. Aim of the study: the project consists of two sub-studies STUDY 1 To evaluate EPC number in a population of healthy young subjects, in relation to the presence of the traditional CV risk factors particularly insulin resistance (IR) STUDY 2 To evaluate LTL in healthy young adults, in relation to the presence of CV risk factors, subclinical atherosclerosis and the cumulative index of CV risk. Methods: EPC number was evaluated in 122 young healthy subjects (73M/49F; 37±8yrs), normotensive and not taking any medication. The main clinical and anthropometric variables were evaluated in all subjects. Fasting blood samples were drawn in each subject for the determination of plasma glucose, insulin (IRI), lipid profile, uric acid, high sensitive C-reactive protein (hsCRP), PAI-1 and EPC number. IR was defined on the basis of fasting IRI values. A B-mode ultrasound examination was performed to determine the Intima Media Thickness (IMT), as a validate marker of subclinical atherosclerosis, and the Framingham Risk score (FRs) was calculated, as a cumulative index of CV risk. EPCs were identified as cells positive for CD34, CD133 and Kinase insert Domain Receptor (KDR) cell-surface antigens within the lymphomonocytes, by flow cytometry analysis. We firstly optimised the experimental conditions: red cells lysis and FACS parameters. Non-specific binding of IgG1 was used as negative control (isotype). LTL was measured in a subgroup of 82 subjects starting from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). DNA isolated from PBMCs was amplified by a specific quantitative real-time PCR reaction to evaluate telomere length. In parallel a single copy gene amplification was performed to obtain normalized data. LTL is expressed as T/S ratio values. Risults: STUDY 1 EPC number resulted inversely correlated with body mass index (rho=-0.18;p<0.05), waist (-0.2;<0.05), systolic (-0.23;<0.01) and diastolic blood pressure (-0.21;<0.05), uric acid (-0.24;<0.005), PAI-1 (-0.19;<0.05) and IRI (-0.2;<0.05) and directly correlated with HDL-cholesterol (0.18;<0.05). EPC number was lower in males and the male gender was the only independent predictor of low EPC count (p<0.05). By dividing the population in four subgroups based on gender and insulin resistance, EPC levels were lower in insulin resistant compared to insulin sensitive males (p<0.05) with no differences in females. STUDY 2 LTL resulted inversely correlated with age (rho=-0.24; p<0.05), waist (-0.29;<0.01), triglycerides (-0.25;<0.05), PAI-1 (-0.28;=0.01), hsPCR (-0.23;<0.05), IMT (-0.24;<0.05) and FRs (-0.28;<0.01) and directly correlated with HDL-cholesterol (0.35;=0.001) and EPC count (0.26;<0.05). IMT, HDL-cholesterol, and EPC number resulted independently correlated to LTL (p<0.05). Conclusions: STUDY 1 The male gender is an independent predictor of low EPC levels in healthy subjects. This might contribute to explaining the higher CV risk in males compared to pre-menopausal age-matched females. In this study a reduced EPC number in insulin resistant males represents one of the putative mechanisms by wich IR is paralleled by a worsening of the CV risk. STUDY 2 These data suggest that LTL can be considered a new early marker of CV risk and subclinical atherosclerosis also in healthy young adults with low CV risk. The independent correlation between LTL and EPC number and the common bone marrow origin, suggest a shared pathophysiological mechanism of impairment leading to the progression of CV disease. EPC number and LTL can be considered new markers for the early stratification of CV risk also in a population of healthy young adults. Longitudinal prospective studies are warranted to validate their prognostic value.