Applicazione di metodologie molecolari nella diagnosi di malattia da infezione associata a Clostridium difficile

Abstract

Clostridium difficile è un bacillo anaerobio, Gram-positivo, sporigeno, responsabile di una malattia diarroica e/o di coliti di varia gravità fino alla colite pseudomembranosa nonché uno dei maggiori responsabili di epidemie intraospedaliere. I principali fattori di virulenza di C. difficile sono rappresentati da due tossine principali: l’ enterotossina A (TcdA), la citotossina B (TcdB), codificate dai geni tcdA e tcdB localizzati nel Locus di patogenicità di C. difficile (PaLoc), e da una tossina addizionale, la tossina binaria (CDT), sintetizzata a partire da due diversi geni, cdtA e cdtB, localizzati esternamente al PaLoc. Alcuni ceppi di C. difficile producono tossine A e B varianti e presentano delezioni e/o mutazioni anche in altre regioni del PaLoc. Dal momento che queste mutazioni sono più frequenti in presenza dei geni codificanti per la tossina binaria, la presenza dei geni cdtA and cdtB è pertanto considerata un buon indicatore per la rivelazione di ceppi varianti di C. difficile. Ad oggi sono stati identificati 27 tipi di varianti, denominate da I a XXVII In questo studio sono stati analizzati 438 ceppi di C. difficile, isolati nel corso di setti anni (2000-2006) da 334 pazienti. Per caratterizzare la tossinogenicità dei ceppi, sono state applicate una duplex PCR per la ricerca dei geni tcdA e tcdB ed una PCR in grado di rilevare i geni cdtA e cdtB. Inoltre, è stata eseguita mediante PCR-ribotyping la tipizzazione dei ceppi isolati, allo scopo di tracciare un quadro epidemiologico sulla circolazione dei ribotipi di C. difficile nell’azienda ospedaliero-universitaria di Parma. Infine, è stato approfondito lo studio molecolare dei ceppi di C. difficile risultati varianti (cdtA/B+) con l’analisi del PaLoc mediante toxinotyping e successiva analisi del gene regolatore negativo tcdC, nonché con la verifica della loro sensibilità in vitro ad alcuni chemioantibiotici, fluorochinoloni in particolare come “marker” di patogenicità. Dei 438 ceppi complessivamente esaminati, 390 sono risultati tossinogenici e di questi 125 (32,1%) hanno presentato i geni codificanti per la tossina binaria, che caratterizza i ceppi varianti. Questi ultimi rappresentano il 44% dei ceppi tossinogenici isolati negli anni 2001-2003 e solo il 13% dei ceppi isolati negli anni 2004-2006, un dato che appare in controtendenza rispetto a quelli osservati in altri Paesi. Analizzando i 438 ceppi mediante PCR-ribotyping sono stati trovati 76 differenti ribotipi, arbitrariamente denominati. In particolare, nell’ambito dei 125 ceppi ctdA+ ctdB+ sono stati trovati 8 differenti ribotipi. Il ribotipo più diffuso tra i ceppi varianti è il ribotipo 1, che caratterizza il 94,4% di questi ceppi (118 su 125 totali); di questi ultimi 103 ceppi (82,4%) appartengono al sottotipo 1a risultato responsabile dell’epidemia, che ha coinvolto 15 pazienti ricoverati nei Reparti geriatrici (dic. 2002 - apr. 2003). I nostri ceppi ribotipo 1a sono stati riclassificati mediante pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) e rinominati internazionalmente mediante PCR-ribotyping come NAP7/ribotipo 078. Quarantatrè dei 125 ceppi potenzialmente CDT+ sono stati selezionati, in base al ribotipo ed all’appartenenza allo stesso paziente, per le successive fasi di analisi del PaLoc e della sensibilità in vitro ai chemioantibiotici. Di questi l’ 86% ha mostrato di appartenere al tossinotipo V, che caratterizza anche la totalità dei ceppi ribotipo 1, mentre quattro sono stati tipizzati come tossinotipo XXIV ed hanno mostrato ribotipi differenti: 5 (2 ceppi), 11 e 16. Relativamente all’analisi mediante PCR-ribotyping dei 313 ceppi non varianti è stata rilevata la presenza di 4 ribotipi predominanti: il ribotipo 13 (45 ceppi, 14,4%), il ribotipo 17 (85 ceppi, 27,3%), il ribotipo 18 (32 ceppi, 10,3%) e il ribotipo 33 (28 ceppi, 9%). Tra questi, un ceppo appartenente al ribotipo 17 è risultato responsabile di una epidemia, che ha coinvolto 42 pazienti ricoverati nei Reparti pneumologici (apr.-sett. 2006). L’analisi del gene regolatore negativo tcdC ha messo in evidenza che i ceppi ribotipo 1 tossinotipo V posseggono un allele, già descritto in letteratura, denominato A1 che, oltre ad una delezione di 39 pb, presenta una mutazione non senso con la conseguente produzione di una proteina tronca non funzionale. Il quadro molecolare emerso suggerisce che questi ceppi sono da considerarsi iperproduttori delle tossine principali A e B. Questi ceppi ribotipo 1a tossinotipo V si sono dimostrati anche altamente resistenti ai fluorochinoloni, come riportato in letteratura. Una variabilità maggiore, al contrario, si è osservata con i ceppi che presentavano ribotipo diverso da 1. Sono state trovate, infatti, 5 nuove sequenze alleliche e tre proteiche non ancora descritte in letteratura. Inoltre, da segnalare è il ceppo ribotipo 2 tossinotipo XXIV, che ha presentato mutazioni insolite per questo tossinotipo, normalmente dotato di un PaLoc identico a quello del ceppo VPI 10463. Interessante è stato anche ritrovare in un ceppo ribotipo 2 un nuovo tossinotipo, non ancora descritto in letteratura. Il nostro studio sottolinea inequivocabilmente l’importanza dell’analisi molecolare, quando condotta per monitorare attentamente la circolazione dei ceppi di C. difficile in ambiente ospedaliero e particolarmente di quelli ipervirulenti, come dimostrano i ceppi Nap7/Ribotipo078 tossinotipo V, comparsi nel nostro ospedale nel 2002-2003, responsabili di una grave epidemia nosocomiale.

Clostridium difficile is a Gram-positive spore-forming anaerobic bacterium, often involved in severe C. difficile-associated disease (CDAD) and outbreaks in hospital settings. The main virulence factors of C. difficile are represented by two large toxins: toxin A (TcdA, enterotoxin), toxin B (TcdB, cytotoxin), encoded by tcdA and tcdB genes, located in the pathogenicity Locus of C. difficile (PaLoc), and an additional toxin, the binary toxin (CDT), codified by two different genes, cdtA and cdtB, located outside the PaLoc. Some strains produce variant toxin A and B and present deletions and/or mutations also in other regions of the PaLoc. Since these mutations are more frequent in presence of the genes encoding for the binary toxin, the presence of cdtA and cdtB genes is therefore considered a good marker to detect variant C. difficile strains. To date, 27 variant types have been identified, named from I to XXVII. In this study, 438 C. difficile strains have been investigated, isolated from 334 patients over a seven year period (2000-2006). A duplex PCR for the detection of tcdA and tcdB genes and a PCR to detect the cdtA and cdtB genes have been applied in the attempt to characterize their toxinogenicity. Furthermore, all the C. difficile isolates have been typed by PCR-ribotyping in order to draw an epidemiological feature of the different ribotypes circulating in the environment of the university hospital in Parma. In addition, a thorough molecular study of the C. difficile variant strains (cdtA/B+) has been done by toxinotyping and subsequent analysis of the negative regulator gene tcdC. Finally, the in vitro susceptibility to some antibiotics has been tested, in particular to fluoroquinolones as a marker of pathogenicity. Out of the 438 C. difficile isolates examined in total, 390 were toxigenic and, among them, 125 (32.1%) harboured the genes encoding for the binary toxin, which characterizes variant strains. These strains account for the 44% of the toxigenic strains isolated in the years 2001-2003 and only for the 13% of the strains isolated in the years 2004-2006, data which appear in contrast with those observed in other countries. Moreover, 76 different ribotypes, arbitrarily named, have been found among these 438 C. difficile strains by PCR-ribotyping. All the 125 variant strains ctdA+ ctdB+ belonged only to 8 different ribotypes and the ribotype 1 accounted for the 94.4% of the total strains. In particular, 103 strains (82.4%) have been classified to belong to the subtype 1a, which was responsible of a severe outbreak, involving 15 patients hospitalised in geriatric wards (Dec. 2002 - Apr. 2003). Of interest, the strains ribotype 1a have been reclassified by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and renamed internationally by PCR-ribotyping as NAP7/ribotype 078. Forty-three of the 125 potentially CDT+ strains have been selected, on the basis of the ribotype and their belonging to the same patient, for the subsequent phases of the PaLoc analysis and in vitro susceptibility to antibiotics. The 86% of these variant strains belonged to toxinotype V, which also included all the strains ribotype 1. Four of them were typed as toxinotype XXIV, but belonged to three different ribotypes: 5 (2 strains), 11 and 16. With regard to the 313 non variant strains analysed by PCR-ribotyping 4 different ribotypes have been predominantly detected: ribotype 13 (45 strains, 14.4%), ribotype 17 (85 strains, 27.3%), ribotype 18 (32 strains, 10.3%) and ribotype 33 (28 strains, 9%). Worthy of note, a C. difficile strain belonging to ribotype 17 has been proven to be responsible for an outbreak, which involved 42 patients hospitalised in pneumology wards (April-Sept. 2006). The analysis of the negative regulator gene tcdC has shown that the strains ribotype 1a toxinotype V had an allele, named A1, previously described in the literature. This allele, in addition to a 39-bp deletion, exhibited a non sence mutation with the consequent production of a truncated non-functional protein. This molecular framework suggests that these strains have to be considered hyper producers of the main toxins A and B. As expected, these ribotype 1a toxinotype V strains turned out in our hands to be highly resistant to fluoroquinolones. On the contrary, a greater variability was observed with the strains that showed ribotypes different from 1. In fact, 5 new allelic sequences and three proteins have been found, that had not described yet in the literature. Interestingly, the strain ribotype 16 toxinotype XXIV presented mutations that were unusual for this toxinotype, which normally has the same PaLoc of the reference strain VPI 10463. Moreover, worthy of note has been to find among the strains belonging to the ribotype 2 a new toxinotype, not yet described in the literature. Our study clearly highlights the importance of the molecular investigations in the attempt to monitor carefully the circulation of C. difficile strains in a hospital environment and particularly, of those hyper virulent strains, such as the Nap7/Ribotipo078 toxinotype V ones, which appeared in our hospital during the 2002-2003 period and were proven to be responsible for a severe nosocomial outbreak.