Detection of peanut allergens by means of new PCR based methods and ELISA

Abstract

Peanut is one of the most allergenic foods since even low amounts of this ingredient can trigger severe allergic reactions up to life-threatening symptoms. The goal of this thesis was therefore to design and develop new DNA based methods for detection of peanut allergens residues in real foodstuffs. Three real-time PCR assays were developed and applied to analysis of cookies and chocolate model matrices with particular regard to respectively the effect of heat treatment and cocoa content. A comparative study between real-time PCR and protein based kits was performed on hundreds of market samples showing that, although different peanut target molecules are detected, real-time PCR and ELISA offer a comparable performance. Design of new methods also embraced the applicability of innovative chemistries based on PNA probes. Circular dichroism, microarray and light up probe were the technologies studied which showed the potential of PNA in the detection of peanut traces in real food samples.

L'arachide è ritenuto uno degli alimenti piú allergenici. Nel caso di soggetti sensibilizzati, anche piccole quantitá di questo alimento possono scatenare reazioni allergiche molto severe i cui sintomi possono anche condurre alla morte. L'obiettivo principale di questa tesi è quello di progettare e sviluppare nuovi metodi per la determinazione di tracce di allergeni di arachide in prodotti alimentari mediante il riconoscimento del suo DNA. Sono stati disegnati e ottimizzati tre diversi sistemi di real-time PCR, successivamente applicati all'analisi di matrici alimentari quali biscotti o cioccolato. Particolare attenzione é stata rivolta all'effetto che il trattamento termico subito dal campione o il contenuto di cacao possono avere sulla determinazione dell'arachide. Successivamente, un piú ampio studio comparativo é stato svolto analizzando centinaia di campioni commerciali con il nuovo sistema real-time PCR e parallelamente con kit basati sulla determinazione di proteine di arachide. Nonostante la molecola oggetto d'indagine fosse in un caso DNA e nell'altro una proteina, entrambi i metodi hanno fornito risultati comparabili. La ricerca e lo sviluppo di nuovi metodi d'indagine degli allergeni negli alimenti ha anche incluso lo studio e l'applicazione di tecniche particolarmente innovative basate sull'uso delle sonde ad Acido Peptido Nucleici (PNA). Sonde a PNA sono state sfruttate in combinazione con diverse tecniche, quali il dicroismo circolare, la tecnologia microarray o, nel caso particolare delle sonde Light Up probe, in real-time PCR.