L ‘effetto del secretoma di cellule staminali mesenchimali sulla coagulazione del plasma sanguigno in specie d'interesse veterinario.

Abstract

Negli ultimi decenni è stato dimostrato che l’efficacia terapeutica rigenerativa delle cellule staminali mesenchimali (MSC) è dovuta principalmente al loro biosecretoma (MSCs), che è costituito da un elevato numero di molecole bioattive rilasciate nello spazio extracellulare tramite secrezione. Queste sono sia in forma solubile che all’interno di vescicole extracellulari. Basandosi su queste premesse, Bari e colleghi hanno di recente presentato nell’articolo: “Pilot production of mesenchymal stem/stromal freeze-dried secretome for cell-free regenerative nanomedicine: a validated GMP-compliant process (2018). Cells 7.11, p. 190” una procedura innovativa e conforme alle norme GMP (Good Manufacturing Practice) per la produzione su larga scala di un prodotto farmaceutico costituito da MSCs di tessuto adiposo (AT-MSCs), che venendo sottoposto a liofilizzazione, viene denominato ‘Liosecretoma’. Questo prodotto, che può venire riscostituito mediante aggiunta di acqua sterile, è classificabile come un farmaco pronto all’uso, potenzialmente in grado di rimpiazzare le terapie a base di cellule staminali nel campo della medicina rigenerativa. Poiché il processo coagulativo viene favorito dalla presenza di materiale micro e nano particolato e di sostanze procoagulanti che si trovano all’interno del liosecretoma, nel presente elaborato di tesi è stato verificato, per la prima volta in modo quantitativo, il suo effetto, in vitro, sulla formazione del coagulo di fibrina nelle specie canina ed equina. Lo sviluppo di torbidità causata dal processo coagulativo in funzione del tempo in campioni di plasma deprivato delle particelle endogene (mediante centrifugazione o ultracentrifugazione), è stata valutata attraverso l’aumento dell’assorbanza, sia in assenza che in presenza di quantità crescenti di liosecretoma. Le cinetiche di coagulazione seguono un andamento nel tempo che è descritto da funzioni sigmoidee a tre parametri, dalle quale è possibile valutare la fase di latenza del processo, il tempo in cui si realizza metà della coagulazione (t1/2 ) e, dalla pendenza al flesso, la velocità con cui il processo si realizza. Il valore finale di torbidità consente inoltre di ipotizzare differenti modalità di formazione del coagulo in funzione della velocità del suo processo di formazione. In entrambe le specie si è evidenziata, all’aumentare della concentrazione di Liosecretoma, una significativa diminuzione dei t1/2 accompagnata da un altrettanto significativo incremento della velocità di formazione del coagulo (aumento della pendenza al flesso). Queste variazioni sono risultate maggiori nella specie canina rispetto a quella equina. La coagulazione dei derivati del plasma indotta in tempi definiti dall’aggiunta di opportune quantità di liosecretoma, potrebbe quindi essere sfruttata anche in ambito clinico per la preparazione, ad esempio, di gel prodotti dalla coagulazione di derivati plasmatici pronti all’uso. Questi prodotti, applicati nella sede di danno permetterebbero alle sostanze utili presenti all’interno del Liosecretoma di rimanere localizzate in situ e di agire direttamente sul tessuto danneggiato.

In recent decades, it has been demonstrated that the regenerative therapeutic efficacy of mesenchymal stem cells (MSCs) is primarily due to their biosecretome (MSCs), which consists of a high number of bioactive molecules released into the extracellular space by secretion. These molecules are both in soluble form and within extracellular vesicles. According to this, Bari and colleagues recently presented in their article: “Pilot production of mesenchymal stem/stromal freeze-dried secretome for cell-free regenerative nanomedicine: a validated GMP-compliant process (2018). Cells 7.11, p. 190” an innovative procedure, compliant with Good Manufacturing Practice (GMP) standards, for the large-scale production of a liophilized pharmaceutical product consisting of adipose tissue-derived MSCs (AT-MSCs), that has been called 'Lyosecretome'. This product, that is reconstituted by adding sterile water, can be classified as a ready-to-use drug, potentially capable of replacing stem cell-based therapies in the field of regenerative medicine. As the coagulation process is facilitated by the presence of micro and nano particulate material and pro-coagulant substances that are also main constituents of the lyosecretome, this thesis investigates, for the first time quantitatively, its effect, in vitro, on the formation of fibrin clot in both canine and equine species. The development of turbidity caused by the coagulation process as a function of time in samples of plasma deprived of the endogenous particles (by centrifugation or ultracentrifugation) was evaluated spectrophotometrically as the increase of the absorbance, both in the absence and presence of increasing amounts of lyosecretome. The coagulation kinetics follow a time course described by three-parameter sigmoid functions, that allow to assess the latency phase of the process, the time required to obtain one half of the coagulation (t1/2 ), and, from the slope at the inflection point, the velocity of the process. The final turbidity value also allows to hypothesize different models of both formation and molecular structure of the fibrin frame within the clot formation as functions of the velocity of the coagulation process. In both animal species, as the concentration of Lyosecretoma increased, a significant decrease of t1/2 was accompanied by an increase of the clot formation velocity (as determined by an increase of the slope at the inflection point). These variations were more pronounced in the canine species compared to the equine. The precise timing of the coagulation process, that is determined by the addition of appropriate quantities of Lyosecrteome, can be of interest for the prompt preparation of ready to use plasma derivatives (as for instance platelet rich and poor plasma gels) suitable for clinical applications in the field of regenerative medicine. Moreover these gels, applied at the site of injury, would allow the beneficial substances present within the Lyosecretoma to remain localized in situ and act directly on the damaged tissue.