Responsiveness of intestinal epithelial cells to eubiotics: IPEC-J2 as in vitro model in swine

Abstract

Gli effetti degli eubiotici sono di notevole interesse in quanto vengono utilizzati come additivi nell'allevamento suino in risposta alle attuali normative volte ad evitare la resistenza agli antibiotici. Dal 2013, l'Organizzazione mondiale della sanità ha vietato gli antibiotici e lo zinco come promotori della crescita. Nello studio 1, abbiamo caratterizzato un modello di co-coltura composto da cellule epiteliali intestinali (IPEC-J2) e cellule immunitarie del sangue periferico (PBMC). L'arginina è un amminoacido essenziale tra le varie sostanze utilizzate in sostituzione degli antibiotici. Utilizzando questo modello, abbiamo valutato come la privazione di arginina induce un aumento del danno intestinale e la conseguente attivazione della risposta immunitaria intestinale. La privazione porta all'immunoregolazione mediata dall'espressione di pro-infiammatori (fattore di necrosi tumorale (TNF)α, interleuchina (IL)-8, interleuchina (IL)-1α, interleuchina (IL)-6) e antinfiammatori (trasformazione Fattore di crescita (TGF)-β) citochine. Tra le altre molecole alternative, gli acidi grassi a catena corta (SCFA), fonti importanti per il metabolismo energetico e i processi anabolici nei mammiferi, possono regolare la risposta infiammatoria e aumentare l'integrità della barriera intestinale. Nello studio 2, abbiamo valutato gli effetti dell'integrazione di SCFA (acetato, butirrato, propionato e lattato) a diverse concentrazioni in IPEC-J2. Gli SCFA migliorano le funzioni delle proteine della giunzione stretta (TJp), che impediscono il passaggio degli antigeni attraverso la barriera intestinale nello spazio paracellulare. I risultati mostrano impatti su IPEC-J2, che dipendono dal tipo e dalla concentrazione specifica di SCFA. L'acetato e il propionato esercitano un'azione protettiva maggiore rispetto al lattato e al butirrato, alle concentrazioni prescelte. Inoltre, l'integrazione di SCFA stimola l'espressione di TJp e β-defensina 1 (BD-1), che, a sua volta, potrebbe essere stata coinvolta nell'inibizione dell'espressione genica del fattore nucleare (NF)-κB e del TNFα. Infine nello studio 3, basato sullo studio precedente, 5 mM di acetato e 1 mM di propionato sono stati usati come trattamenti per la co-coltura su lipopolisaccaridi (LPS), mimando lo stato infiammatorio acuto. L'acetato e il propionato hanno un effetto protettivo mediante la regolazione del TJp sull'infiammazione acuta. In sintesi, è stato caratterizzato un modello di co-coltura di IPEC-J2 e PBMC. Il modello potrebbe essere importante per studiare e chiarire il ruolo delle condizioni nutrizionali nella funzionalità e nella reattività delle cellule epiteliali intestinali (IEC) nei suini. La privazione di arginina colpisce le cellule epiteliali intestinali e stimola la loro risposta funzionale; l'amminoacido funge da modulatore della risposta antinfiammatoria locale per adattarsi e reagire a uno stimolo stressante. Inoltre, i dati potrebbero essere tradotti nell'uomo che ci sono somiglianze tra maiali e umani in termini di microbiota intestinale e nei meccanismi dei sistemi di difesa intestinale. Infine, gli SCFA hanno ruoli protettivi a livello intestinale. Abbiamo evidenziato l'effetto positivo in vitro degli SCFA, anche in presenza di LPS-challenge, sulla vitalità intestinale e sul mantenimento dell'integrità intestinale. Le azioni degli SCFA dipendono dal tipo e dalla concentrazione di essi. Le risposte attivate da arginina e SCFA sono promosse regolando TJp e la secrezione di citochine pro e antinfiammatorie. Pertanto, sarebbe auspicabile che gli SCFA, ampiamente utilizzati nelle diete dei suini, fossero utilizzati in base alle diverse azioni di ciascun SCFA.

The effects of eubiotics are of considerable interest as they are used as additives in pig farming in response to current regulations aiming to avoid antibiotic resistance. Since 2013, World Health Organization banned antibiotics and zinc as growth promoters. In study 1, we characterized a co-culture model composed of intestinal epithelial cells (IPEC-J2) and peripheral blood immune cells (PBMC). Arginine is an essential amino acid among the various substances used to replace antibiotics. Using this model, we evaluated how arginine deprivation induced an increase in intestinal damage and the consequent activation of the intestinal immune response. The deprivation leads to the immunoregulation mediated by the expression of pro-inflammatory (Tumor Necrosis factor (TNF)α, Interleukin (IL)-8, Interleukin (IL)-1α, Interleukin (IL)-6) and anti-inflammatory (Transforming Growth Factor (TGF)-β) cytokines. Among other alternative molecules, Short-Chain Fatty Acids (SCFA), important sources for energy metabolism and anabolic processes in mammals, can regulate the inflammatory response and increase the integrity of the intestinal barrier. In Study 2, we evaluated the effects of SCFA supplementation (acetate, butyrate, propionate, and lactate) at different concentrations in IPEC-J2. SCFA enhance the functions of tight junction proteins (TJp), which prevent the passage of antigens across the intestinal barrier into the paracellular space. The results show impacts on IPEC-J2, that depend on the type and specific concentration of SCFA. Acetate and propionate exhibit a greater protective action than lactate and butyrate, at the chosen concentrations. Moreover, SCFA supplementation stimulates the expression of TJp and β-defensin 1 (BD-1), which, in turn, may have been involved in the inhibition of Nuclear factor (NF)-κB and TNFα gene expression. Finally in study 3, based on the previous study, 5 mM acetate and 1 mM propionate were used as treatments for the co-culture upon lipopolysaccharides (LPS) challenge, miming the acute inflammatory state. Acetate and propionate have a protective effect by TJp regulation upon acute inflammation. 5 In summary, a co-culture model of IPEC-J2 and PBMC has been characterized. The model could be important to study and elucidate the role of nutritional conditions in the functionality and reactivity of the intestinal epithelial cells (IECs) in pigs. Arginine deprivation affects intestinal epithelial cells and stimulates their functional response; the amino acid acts as a modulator of the local anti-inflammatory response to adapt and react to a stressful stimulus. Moreover, the data could be translated to humans that there are similarities between pigs and humans in terms of intestinal microbiota and in the mechanisms of intestinal defense systems. Finally, SCFA have protective roles at the level intestinal. We have highlighted the positive in vitro effect of SCFA, even in the presence of LPS-challenge, on intestinal viability and maintaining intestinal integrity. SCFA actions depend on the type and concentration of them. Responses activated by arginine and SCFA are promoted by regulating TJp and the secretion of pro- and anti-inflammatory cytokines. Therefore, it would be desirable for SCFA, widely used in pig diets, to be utilized based on the different actions of each SCFA.