A reverse immuno-glycoproteomic approach for the discovery of new immunotherapeutic targets

Abstract

A major challenge for the advancement of immunotherapeutic treatment of hematologic neoplastic conditions remains the identification of selective and fully targetable cell surface antigens. Transcriptomic and proteomic data, supported by computational analyses and propelled by experimentation at the single-cell level, are gradually becoming the mainstream approach to unveil novel immunotherapeutic targets. However, most of the discovered targets fail to pass the clinical, or even the preclinical, experimental validation because of not being sufficiently cancer-specific and/or because of the lack of (or failure to produce) suitable immunological agents for their effective targeting. Meanwhile, it is becoming increasingly clear that aberrant post-translational modifications of integral and cell surface-associated/exposed proteins of neoplastic lymphocytes may delineate the outermost cancer-selective antigens for antibody-based therapeutic approaches. Bearing this in mind, the present study has explored the potential to adopt an alternative drug discovery strategy having as a starting point unique monoclonal antibodies (mAbs) raised against highly glycosylated molecules of the cancer cell membrane, followed by determination of the validity of the recognized antigen(s) as putative immunotherapeutic targets. The strategy that we have denominated “reversed immuno-glycoproteomics” was assayed using a follicular lymphoma cell line as model for the initial production of a panel of unique mAbs, which were generated through the conventional murine hybridoma technology. In parallel, a previously available battery of mAbs, originally raised the human cartilage proteoglycan aggrecan, was investigated to confirm a previously proposed cross-recognition of highly glycanated lymphoma cell-associated molecules by a set of similar mAbs. Immunization of mice with complex mixtures of enriched, heavily glycosylated proteins derived from the lymphoma cell line Sci-1 yielded a total of 25 hybridoma clones that were selected for their reactivity against Sci-1 cell extracts. This panel of mAbs was initially assayed against a panel of 98 lymphoma and leukemia cell lines by flow cytometry to select the ones reacting with native, surface-exposed antigens. This screen identified a subset of 25 antibodies which were differentially tested on healthy peripheral blood mononucleated cells and immortalized lymphocytes to determine their cancer cell-specificity. Four lead mAbs were derived from these tests and these antibodies were surveyed by flow cytometry, immunocytochemistry and immunoblotting against a panel of >100 cell lines representing all major lymphoma and leukemia subtypes, such as to categorize and prioritize the pathologies of potentially highest clinical interest. A parallel flow cytometry-based screening of 17 mAbs originally raised against cartilage aggrecan confirmed the previously proposed expression on lymphomas of highly glycosylated surface antigens. A first effort to disclose the antigens recognized by mAbs raised against plasma membrane-associated macro-complexes was pursued by conventional immunoprecipitation (IP)/shot-gun, label-free mass spectrometry and screening of protein arrays spotted with >20,000 recombinant human proteins. While refinement of the sample preparation and IP procedures are still needed to yield trustable and reproducible information on the nature of the recognized antigen, surprisingly, protein array screening identified as a primary candidate protein believed to be transiently exposed on the outer cancer cell surface. Treatment of model cell lines of diverse pathological origin with the four lead mAbs was found to induce cell aggregation, interfere with proliferation and induce regulated cell death, in an antibody versus cell phenotype-specific manner, suggesting that the recognized surface antigens are functionally linked to cell survival pathways. Accordingly, combined treatment of model cells with low doses of doxorubicin and the most effective pro-cytotoxic antibody strongly accentuated the cell death-inducing effect exerted by each of the agents alone. While a full structural-functional characterization of the antigens recognized by the unique antibodies investigated in this study awaits to be completed, several of these immunological agents seem to possess the proper attributes to further explored preclinically as putative immunotherapeutic drugs

Una sfida importante per il progresso del trattamento immunoterapico delle condizioni neoplastiche ematologiche rimane l'identificazione di antigeni di superficie cellulare selettivi e completamente mirabili. I dati trascrittomici e proteomici, supportati da analisi computazionali e spinti dalla sperimentazione a livello di singola cellula, stanno gradualmente diventando l'approccio principale per svelare nuovi bersagli immunoterapeutici. Tuttavia, la maggior parte dei bersagli scoperti non supera la validazione clinica, o anche preclinica, sperimentale perché non è sufficientemente specifica per il cancro e/o per la mancanza di (o la mancata produzione) di agenti immunologici adatti per il loro targeting efficace. Nel frattempo, sta diventando sempre più chiaro che le modificazioni post-traduzionali aberranti delle proteine integrali e associate alla superficie cellulare/esposte dei linfociti neoplastici possono delineare gli antigeni selettivi del cancro più esterni per approcci terapeutici basati su anticorpi. Tenendo questo in mente, il presente studio ha esplorato il potenziale per adottare una strategia di scoperta di farmaci alternativi avente come punto di partenza anticorpi monoclonali unici (mAb) sollevati contro molecole altamente glicosilate della membrana cellulare tumorale, seguita dalla determinazione della validità del riconosciuto antigeni come presunti bersagli immunoterapeutici. La strategia che abbiamo denominato "immuno-glicoproteomica invertita" è stata saggiata utilizzando una linea cellulare di linfoma follicolare come modello per la produzione iniziale di un pannello di mAbs unici, che sono stati generati attraverso la tecnologia convenzionale dell'ibridoma murino. Parallelamente, è stata studiata una batteria precedentemente disponibile di mAbs, originariamente sollevata dal proteoglicano aggrecano della cartilagine umana, per confermare un riconoscimento incrociato precedentemente proposto di molecole associate a cellule di linfoma altamente glicanato da parte di un insieme di mAbs simili. L'immunizzazione di topi con miscele complesse di proteine arricchite e fortemente glicosilate derivate dalla linea cellulare di linfoma Sci-1 ha prodotto un totale di 25 cloni di ibridoma che sono stati selezionati per la loro reattività contro gli estratti di cellule Sci-1. Questo pannello di mAb è stato inizialmente analizzato contro un pannello di 98 linee cellulari di linfoma e leucemia mediante citometria a flusso per selezionare quelle che reagivano con antigeni nativi esposti in superficie. Questo screening ha identificato un sottogruppo di 25 anticorpi che sono stati testati in modo differenziato su cellule mononucleate sane del sangue periferico e linfociti immortalizzati per determinare la loro specificità cellulare tumorale. Da questi test sono stati derivati quattro mAb di piombo e questi anticorpi sono stati esaminati mediante citometria a flusso, immunocitochimica e immunoblotting contro un pannello di > 100 linee cellulari che rappresentano tutti i principali sottotipi di linfoma e leucemia, in modo tale da classificare e dare priorità alle patologie di potenziale interesse clinico più elevato. Uno screening basato sulla citometria a flusso parallelo di 17 mAbs originariamente diretto contro l'aggrecan della cartilagine ha confermato l'espressione precedentemente proposta sui linfomi di antigeni di superficie altamente glicosilati. Un primo tentativo di rivelare gli antigeni riconosciuti dagli mAb generati contro i macrocomplessi associati alla membrana plasmatica è stato perseguito mediante immunoprecipitazione convenzionale (IP)/shot-gun, spettrometria di massa senza etichetta e screening di matrici proteiche individuate con > 20.000 proteine umane ricombinanti. Mentre il perfezionamento della preparazione del campione e le procedure IP sono ancora necessarie per fornire informazioni affidabili e riproducibili sulla natura dell'antigene riconosciuto, sorprendentemente, lo screening dell'array proteico identificato come una proteina candidata primaria si ritiene sia transitoriamente esposta sulla superficie esterna delle cellule tumorali. È stato riscontrato che il trattamento di linee cellulari modello di diversa origine patologica con i quattro mAb di piombo induce l'aggregazione cellulare, interferisce con la proliferazione e induce la morte cellulare regolata, in un modo anticorpo contro fenotipo cellulare specifico, suggerendo che gli antigeni di superficie riconosciuti sono funzionalmente collegati a percorsi di sopravvivenza cellulare. Di conseguenza, il trattamento combinato di cellule modello con basse dosi di doxorubicina e l'anticorpo pro-citotossico più efficace ha fortemente accentuato l'effetto di induzione della morte cellulare esercitato da ciascuno degli agenti da solo. Mentre una completa caratterizzazione strutturale-funzionale degli antigeni riconosciuti dagli unici anticorpi studiati in questo studio attende di essere completata, molti di questi agenti immunologici sembrano possedere gli attributi appropriati per essere ulteriormente esplorati in fase preclinica come presunti farmaci immunoterapici.