Sistemi di trasporto basati su proteine e dotati di capacità di indirizzamento per l’inattivazione fotodinamica di microorganismi

Abstract

Dall'introduzione degli antibiotici, i microrganismi hanno iniziato a sviluppare resistenza ad essi e oggigiorno, a causa dell'abuso di questi farmaci e della mancata scoperta di nuove classi di antibiotici, la resistenza antimicrobica è una delle minacce più urgenti per la salute pubblica mondiale.

Tra i microrganismi, la resistenza batterica agli antibiotici è una “pandemia silenziosa” che nel 2019 ha portato alla morte di quasi 5 milioni di persone e, senza azioni e innovazioni, nel 2050 il tasso di mortalità salirà a 10 milioni. Da questo punto di vista, uno dei batteri più preoccupanti è S. aureus, classificato dall'OMS come batterio ad alta priorità.

Lo scopo di questo progetto è lo sviluppo di complessi supramolecolari per la terapia fotodinamica antimicrobica mirata (aPDT) contro i batteri, in particolare S. aureus.

La aPDT è una tecnica promettente per contrastare la resistenza agli antibiotici grazie alla sua rapida azione e alla sua capacità di bersagliare diverse biomolecole. Pertanto, non si prevede che i microrganismi sviluppino resistenza alla aPDT. La PDT si basa sull'utilizzo di fotosensibilizzatori (PSs), cioè molecole che possono essere eccitate dalla luce visibile di opportuna lunghezza d'onda e, dagli stati eccitati, generare specie reattive dell'ossigeno tossiche per la cellula bersaglio. Dopo la fotoeccitazione a uno stato elettronico eccitato, un PS normalmente subisce la transizione allo stato di tripletto, che può interagire con l'ossigeno molecolare in due modi diversi, per trasferimento di elettroni (tipo I) o per trasferimento di energia (tipo II), portando alla formazione di specie reattive dell'ossigeno (radicali e ossigeno singoletto, rispettivamente). Queste specie altamente reattive hanno un'azione citotossica, tramite il danneggiamento delle macromolecole biologiche presenti nelle cellule, portando alla morte cellulare.

Utilizzando un approccio modulare, in questo lavoro, abbiamo sviluppato complessi supramolecolari in grado di trasportare il PS alla cellula bersaglio. Questi complessi sono formati da tre componenti: il PS, il sistema di giunzione e il sistema di indirizzamento. Il PS provoca l'azione fotocitotossica quando viene esposto alla luce visibile, e il sistema di giunzione, formato da streptavidina (una proteina tetramerica) e biotina (una vitamina), collega il PS al sistema di indirizzamento che permette di portare l'unità fotoattiva verso le cellule bersaglio.

Abbiamo scelto questo approccio perché è intrinsecamente flessibile. I PSs possono essere modificati aggiungendo ad essi un gruppo chimico appropriato che sia reattivo nei confronti delle catene laterali degli amminoacidi (Lys, Cys, …) e permetta quindi di legarli alle proteine, nel nostro caso la streptavidina. A seconda del tipo di molecola/cellula bersaglio, è possibile scegliere una proteina di indirizzamento appropriata che può essere funzionalizzata con la biotina. Infine, sfruttando l'elevata affinità tra streptavidina e biotina, è possibile legare le due parti (PS-streptavidina e molecola bersaglio biotinilata) per formare il complesso supramolecolare.

Abbiamo realizzato e caratterizzato due diversi complessi: uno che ha l’eosina come PS e l'anticorpo immunoglobulina G (IgG) come sistema di indirizzamento e uno che sfrutta il blu di metilene come PS e la proteina concanavalina A (ConA) come sistema di indirizzamento.

Usando anisotropia di fluorescenza e FCS abbiamo confermato che entrambi i PS (EITC e MB, rispettivamente) sono legati alla streptavidina.

Abbiamo caratterizzato alcune proprietà fotofisiche di EITC-streptavidina e MB-streptavidina e, in entrambi i casi, abbiamo osservato che quando il PS è legato alla proteina, tutte le rese quantiche (di fluorescenza, formazione dello stato di tripletto e formazione di ossigeno singoletto) diminuiscono. Inoltre, con la streptavidina marcata con EITC abbiamo notato che le rese quantiche diminuiscono all'aumentare del numero di molecole di PS presenti sulla stessa proteina.

Usando FCS abbiamo confermato che la streptavidina marcata si lega al sistema di indirizzamento biotinilato (IgG e ConA, rispettivamente) e che quest'ultimo è necessario per bersagliare i batteri; ciò è stato ulteriormente confermato dalla fotoinattivazione in cui in assenza del sistema di indirizzamento la morte cellulare era ordini di grandezza inferiore (circa 4 log).

Le misurazioni al microscopio hanno mostrato che il primo complesso bersaglia selettivamente S. aureus, mentre il secondo bersaglia sia S. aureus che E. coli.

Infine, eseguendo test di fotoinattivazione abbiamo ottenuto una morte cellulare efficiente contro S. aureus con il primo complesso (8 log con 2 µM di EITC e 50 J/cm2) e una morte cellulare equivalente sia per S. aureus che per E. coli con il secondo complesso (4 log con 5 µM di MB e 200 J/cm2).

Since the introduction of antibiotics, microorganisms have started to develop resistance to them and nowadays, due to the abuse of these drugs and the lack of discovery of new classes of antibiotics, antimicrobial resistance is one of the most pressing threats for world public health.

Among microorganisms, bacterial resistance to antibiotics is a “silent pandemic” that in 2019 led to the deaths of nearly 5 million people and, without actions and innovations, in 2050 the death rate will rise to 10 million. From this point of view, one of the most worrying bacteria is S. aureus, classified by the WHO as a high priority bacterium.

The aim of this project is to develop supramolecular complexes for targeted antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) against bacteria, in particular S. aureus.

aPDT is a promising technique for countering antibiotic resistance thanks to its fast action and its ability to target different biomolecules. Therefore, microorganisms are not expected to develop resistance to aPDT. PDT is based on the use of photosensitizers (PS), i.e. molecules that can be excited by visible light of appropriate wavelength and, from the excited states, generate reactive oxygen species that are toxic for the target cell. After photoexcitation to an electronically excited state, a PS normally undergoes transition to the triplet state, which can interact with molecular oxygen in two different ways, by electron transfer (type I) or by energy transfer (type II), leading to the formation of reactive oxygen species (radicals and singlet oxygen, respectively). These highly reactive species have a cytotoxic action, through damage to biological macromolecules present in cells, leading to cell death.

Using a modular approach, in this work, we developed supramolecular complexes that are able to deliver the PS to the target cell. These complexes are formed by three components: the PS, the junction system and the targeting system. The PS elicits the photocytotoxic action when exposed to visible light, and the junction system, formed by streptavidin (a tetrameric protein) and biotin (a vitamin), connect the PS to the targeting system which allows to drive the photoactive unit towards the target cells.

We chose this approach because it is inherently flexible. PSs can be modified by adding to them an appropriate chemical group that is reactive towards amino acid side chains (Lys, Cys, …) and thus allows binding them to proteins, in our case streptavidin. Depending on the target molecule/cell type, it is possible to choose an appropriate targeting protein that can be functionalized with biotin. Finally, by exploiting the high affinity between streptavidin and biotin, it is possible to link the two parts (PS-streptavidin and biotinylated targeting molecule) to form the supramolecular complex.

We have created and characterized two different complexes: one that has eosin as PS and the antibody Immunoglobulin G (IgG) as targeting system and one that contains methylene blue as a PS, and the protein concanavalin A (ConA) as the targeting system.

Using fluorescence anisotropy and FCS we confirmed that both the PSs (EITC and MB, respectively) are bound to streptavidin.

We characterized some photophysical properties of EITC-streptavidin and MB-streptavidin, and in both cases, we observed that when the PS is bound to the protein, all quantum yields (of fluorescence, triplet state formation and singlet oxygen formation) decrease. Furthermore, with the EITC-labeled streptavidin we noticed that the quantum yields decrease as the number of PS molecules present on the same protein increase.

Using FCS we confirmed that labeled streptavidin bound to biotinylated targeting system (IgG and ConA, respectively) and that the latter is required to target bacteria; this was further confirmed by the photoinactivation where in absence of the targeting system the cell death was orders of magnitude lower (around 4 logs).

Microscopy measurements showed that the first complex selectively target S. aureus, while the second one target both S. aureus and E. coli.

Finally, performing photoinactivation tests we obtained an efficiently cell death against S. aureus with the first complex (8 logs with 2 µM of EITC and 50 J/cm2) and an equivalent cell death for both S. aureus and E. coli with the second complex (4 logs with 5 µM of MB and 200 J/cm2).