Valutazione dell'impiego dell'embryo transfer e del congelamento embrionale bovino nel management riproduttivo aziendale

Abstract

L’embryo transfer è una tecnica di riproduzione assistita ampiamente utilizzata nella specie bovina che prevede la raccolta di embrioni, solitamente provenienti da una bovina di elevato valore genetico, e il conseguente trasferimento degli stessi in bovine riceventi. Questa tecnica può trovare varie applicazioni, può essere utilizzata per: aumentare progressivamente il valore genetico all’interno della mandria; trasportare embrioni anziché animali vivi, la qual cosa risulta molto più pratica e permette di prevenire la diffusione di malattie infettive; salvaguardare particolari razze a limitata diffusione; far fronte a problemi di fertilità che possono affliggere la mandria, in particolare il problema delle cosiddette repeat breeder e particolari condizioni che possono ridurre la fertilità delle bovine da latte come lo stress da caldo (in questo caso l’utilizzo di questa tecnica viene definito embryo therapy). La selezione delle donatrici si basa sul valore genetico e sull’adeguatezza riproduttiva la quale viene stabilita dal medico veterinario anche grazie all’uso dell’ultrasonografia. La competenza riproduttiva può essere determinata anche misurando la concentrazione di ormone Anti-Mülleriano che può essere considerato un valido marker endocrino di riserva ovarica di follicoli antrali. La raccolta degli embrioni prevede l’induzione di un’ovulazione multipla attraverso un trattamento ormonale. Per ottenere questa superovulazione il protocollo più utilizzato richiede somministrazioni intramuscolari di pFSH due volte al giorno per 3-4 giorni non prima di aver manipolato l’insorgenza delle ondate follicolari e ciò può essere realizzato in vari modi. Recentemente alcuni ricercatori hanno valutato vie di somministrazione alternative dell’FSH e diverse formulazioni di pFSH con lo scopo di semplificare il management e di assicurare il benessere animale, ottenendo risultati variabili. Dopo il trattamento per ottenere la superovulazione le donatrici vengono inseminate artificialmente in un momento prestabilito e utilizzando seme di alta qualità, proveniente preferibilmente da tori molto fertili. Infatti recenti studi hanno mostrato che la qualità del seme e il livello di fertilità del toro possono influenzare sia lo sviluppo embrionale che la qualità degli embrioni. Per attuare l’embryo transfer si possono utilizzare sia il seme convenzionale che il seme sessato a patto di modificare il momento dell’inseminazione artificiale quando si impiega il seme sessato. Le riceventi vengono solitamente selezionate tra vacche sane dal punto di vista riproduttivo e che mostrano facilità di parto, buona attitudine lattifera e materna. Gli embrioni ottenuti in vivo possono essere raccolti e trasferiti sia chirurgicamente che non chirurgicamente. Spesso le tecniche non chirurgiche sono da preferirsi. La procedura di flushing prevede anestesia epidurale, introduzione di un catetere Foley attraverso la cervice della vacca donatrice 7 o 8 giorni dopo l’estro, lavaggio dell’utero (o prima di un corno e poi dell’altro) con un medium (solitamente D-PBS) che viene prima introdotto e successivamente aspirato allo scopo di raccogliere gli embrioni, che vengono poi separati dal medium tramite il passaggio attraverso un filtro. Il transfer non chirurgico viene effettuato con una semplice pistolet contenente la paillette con l’embrione che viene rilasciato nel corno uterino corrispondente all’ovaio che presenta un corpo luteo attivo. Diversi fattori possono influenzare il pregnancy rate: il punteggio riferito alla facilità di passaggio della cervice (difficile, moderato, semplice), il punto dove viene collocato l’embrione, la durata del transfer (a causa del rilascio dei mediatori chimici dell’infiammazione), la qualità dell’embrione, la dieta, le anomalie cromosomiche, la crioconservazione e l’ambiente uterino. La classificazione standard degli embrioni si basa su un sistema di codificazione numerico che indica lo stadio dello sviluppo embrionale, che va da 1 (oocita non fertilizzato o embrione con una cellula) a 9 (blastocisti espansa in hatching) e la qualità dell’embrione (1: eccellente o buono; 2: discreto; 3: scarso; 4: morto o in degenerazione). La valutazione degli embrioni bovini viene effettuata solitamente con uno stereomicroscopio e richiede esperienza e competenza. Solo gli embrioni di Grado 1 possono essere utilizzati nel commercio internazionale e solo quelli di Grado 1 e 2 sono idonei al congelamento. Le tre strategie principali applicate per prevenire la trasmissione di patogeni dalle donatrici alle riceventi sono: test sulle donatrici, processamento o trattamento degli embrioni, test sulle riceventi. Una zona pellucida intatta, le procedure raccomandate dalla IETS di lavaggio con tripsina, asepsi, equipaggiamento e materiali da laboratorio sterili sono misure di prevenzione sufficienti ad impedire la diffusione dei principali patogeni e malattie infettive. La criopreservazione semplifica gli scambi internazionali e permette la conservazione di materiale genetico di alto valore per un periodo di tempo illimitato. Può essere effettuata tramite un processo lento o ultra-rapido (la cosiddetta vitrificazione). Per evitare o quantomeno limitare danni cellulari vi è la necessità di adoperare dei crioprotettori tra cui i più frequentemente impiegati sono il Glicerolo e il Glicole Etilenico. La vitrificazione è invece una tecnica ancora in fase di perfezionamento. Infine, prima di introdurre l’embryo transfer in un programma di allevamento, dal punto di vista manageriale è opportuno valutare attentamente i costi associati a questa tecnica, la sua fattibilità economica e il rapporto costi-benefici che potrebbero derivare dal suo impiego.

Embryo transfer is an assisted reproductive technology, largely used in cattle, that involves the recovery of embryos, usually from an elite female donor, and the subsequent transfer to recipient females. This technique can find various applications: it can be used to progressively improve the genetics within the herd; to transport embryos instead of live animals, which is much more practical and prevents the spread of infectious diseases; to safeguard livestock breeds that may be in danger of extinction; to solve fertility problems that affect the herd, in particular repeat breeder cows and conditions that reduce dairy cattle fertility, such as heat stress (so-called embryo therapy). Selection of the donors is based on genetic merit and reproductive adequacy, which is determined by the veterinarian also through the use of ultrasonography. The reproductive competence can also be assessed by measuring the concentrations of Anti-Müllerian hormone, which can be considered a viable endocrine marker of antral follicle count in cattle. The recovery of embryos includes the induction of multiple ovulation by hormonal treatment. To reach superovulation, the common protocol requires intramuscular administration of pFSH twice daily for 3-4 days after manipulation of the follicle wave emergence (which can be performed in various ways). Recently, some scientists have analysed alternative routes of administration of FSH and different pFSH formulations with the aim of simplifying the management and of ensuring the welfare of animals, with variable results. After the superovulation treatment the donors are artificially inseminated at a fixed time with high quality semen, preferably coming from high fertility bulls. In fact, recent studies showed that the quality of the semen and the fertility of the bull can influence embryonic development and quality. To perform embryo transfer both conventional semen and sex-sorted semen can be used but when using sex-sorted sperm the moment of AI should be adjusted. Recipients are usually selected among reproductively healthy cows that display calving ease and have good milking and mothering aptitude. Embryos obtained in vivo can be collected and transferred surgically or non-surgically. Oftentimes the non-surgical techniques are highly preferred. The flushing procedure involves epidural anaesthesia, introduction of a Foley catheter through the cervix of the donor cow 7 or 8 days after estrus, flushing of a medium (usually D-PBS) into and out the uterus (or each uterine horn at time) to pick the embryos, which are separated from the medium through a filter. The non-surgical transfer is performed with a simple transfer gun, containing the straw with the embryo, put into the uterine horn on the same side of the ovary with an active corpus luteum. Many factors can affect the pregnancy rates: cervix transfer score (difficult, moderate or easy), location where the embryo is transferred, duration of the transfer (because of the release of chemical inflammatory mediators), embryo quality, diet, chromosomal abnormalities, cryopreservation, uterine environment. Embryos standard classification is based on a number code system for their stage of development, ranging from 1 (an unfertilized oocyte or a 1-cell embryo) to 9 (expanding hatched blastocyst) and for their quality (1: excellent or good; 2: fair; 3: poor; 4: dead or degenerating). Evaluation of bovine embryos is usually done with a stereomicroscope and requires experience and competence. Only Code 1 embryos can be used for international trade and only Code 1 and 2 embryos are eligible for freezing. The three main strategies used to prevent the transmission of pathogens from donors to embryo recipients are: donor testing, embryo processing or treatment and recipient testing. An intact zona pellucida, IETS recommended washing procedures with trypsin, aseptic technique, sterile equipment and labware are enough to avoid the spread of the main pathogens and infectious diseases. Cryopreservation simplifies trades between countries and allows the storage of high value genetics for an unlimited time. It can be performed with a slow process or with an ultra-fast process (so-called vitrification). To avoid or at least minimise cell damage cryoprotectants must be used, the most widely used are Glycerol and Ethylene glycol. Instead, vitrification is still a technique under development. Ultimately, prior to the introduction of embryo transfer in a breeding program, the costs associated with this technique, its economic feasibility and the cost-benefit ratio should be carefully evaluated.