Saliva: the potential of a diagnostic biofluid

Abstract

La metabolomica è l'analisi sistematica dei metaboliti presenti in un sistema biologico ed è in grado di fornire un'istantanea delle condizioni di salute di un organismo. Può essere utilizzata per la ricerca di biomarcatori utili nella diagnosi e nella stadiazione della progressione di diverse patologie. La spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), una delle principali tecniche analitiche utilizzate in metabolomica, è stata impiegata in questa tesi per tutti i suoi vantaggi, tra cui la riproducibilità, la possibilità di misurare tutti i metaboliti contemporaneamente e la capacità di fornire una quantificazione assoluta dei metaboliti. Questa tesi si propone di: ottimizzare la preparazione del campione salivare per l'analisi metabolomica tramite tecnica 1H-NMR; determinare i profili metabolici di una coorte di soggetti sani in condizioni fisiologiche; identificare i metaboliti salivari che possano espletare la funzione di biomarkers per patologie orali come l’infiammazione, lesioni orali potenzialmente maligne e il carcinoma orale. L'ottimizzazione della preparazione dei campioni di saliva per l'analisi 1H-NMR ha previsto una fase di ultrafiltrazione seguita da una fase di liofilizzazione, che ha consentito un aumento di 5 volte della concentrazione nativa dei metaboliti, permettendone la completa quantificazione. Il metodo è stato convalidato analiticamente e ne sono stati determinati LOQ (limite di quantificazione) e LOD (limite di rilevamento). Sono stati raccolti tre diversi tipi di saliva (intera, parotidea e sottomandibolare/sublinguale) da 20 volontari sani, senza malattie del cavo orale. Sono stati identificati e quantificati metaboliti derivanti sia dal metabolismo endogeno che dalla microflora batterica che popola il cavo orale, presenti in concentrazioni diverse nei tre sottotipi di saliva. Lo stato di salute paradontale della coorte di studio è stato valutato tramite il "Full Mouth Bleeding Score" (FMBS): l’indice di sanguinamento delle mucose orali. L'analisi statistica multivariata del metaboloma della saliva intera ha evidenziato la correlazione tra alcuni metaboliti e FMBS. Questi risultati sono il punto di partenza per lo sviluppo di uno strumento diagnostico che possa rilevare precocemente le condizioni di infiammazione orale, prima che evolvano a stadi più severi, come la parodontite. L'ultima parte dello studio è stata la determinazione dei profili metabolici della saliva intera di pazienti con cancro orale (OSCC) e di pazienti con lesioni orali potenzialmente maligne (leucoplachia e lichen planus). Dati preliminari hanno mostrato alterazioni metaboliche associate alla progressiva trasformazione di lesioni potenzialmente maligne in fenotipi più aggressivi. In particolare, i dati metabolici hanno consentito di distinguere, nei casi di leucoplachia, diversi stadi di displasia epiteliale degenerativa della mucosa orale. Saranno necessarie ulteriori indagini per correlare i dati metabolomici con le caratteristiche cliniche ed epidemiologiche dei pazienti. Per concludere, l'analisi metabolomica 1H-NMR della saliva ha rivelato il potenziale di questo biofluido per lo sviluppo di protocolli e dispositivi per la diagnosi precoce delle patologie orali.

Metabolomics is the systematic and comprehensive analysis of metabolites in a biological system and provides a functional snapshot of an organism's condition. It can be used to discover biomarkers for diagnosis and for staging the disease’s progression. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy, one of the main analytical platforms used in metabolomics, has been employed in this Thesis exploiting its reproducibility, the possibility to measure all metabolites at once, and absolute metabolite quantification. This Thesis aims to: optimize salivary sample preparation for metabolomics analysis; determine physiologic metabolic profiles of a cohort of healthy subjects, identify salivary biomarkers associated with oral pathologies such as inflammation, potentially malignant disorders, and oral carcinoma. The optimization of saliva samples preparation for 1H-NMR analysis includes an ultrafiltration step followed by freeze-drying which allows a 5-fold gain of metabolite's concentration. The method has been validated, and the LOQ and LOD were determined. Three different types of saliva were collected (whole, parotid, and submandibular/sublingual) from 20 healthy volunteers without oral cavity diseases. Metabolites derived from endogenous host metabolism and oral bacterial microflora and differently distributed within the three saliva subtypes were identified and quantified. The periodontal health status of our study cohort was assessed by the "Full Mouth Bleeding Score" (FMBS). Multivariate statistical analysis of the whole saliva highlighted the correlation between some metabolites and FMBS. The identified metabolites represent a dysbiotic oral bacterial colonization that can induce inflammation and gingival bleeding. These findings are the starting point to set up an early diagnostic tool for oral inflammation preceding periodontitis. The last part of the study was the determination of the metabolic profiles of the whole saliva from patients with oral cancer (OSCC) and patients with potentially malignant oral disorders (leukoplakia and lichen planus). Preliminary data showed metabolic alterations associated with the progressive transformation of potentially malignant lesions to neoplastic cells. Noteworthy, the metabolic data allowed also to distinguish, in the leukoplakia cases, different stages of dysplasia degeneration of the oral mucosa. Further investigations will be needed to correlate metabolomic data with subjects' clinical and epidemiological features. To conclude, 1H-NMR metabolomics analysis of saliva revealed its potential for developing design protocols for the early diagnostic of oral pathologies.