Valutazione della correlazione tra uso di sostanze psicoattive e indicatori di metilazione del DNA e danno ossidativo agli acidi nucleici in popolazione sottoposta a stress

Abstract

Le interazioni di sostanze xenobiotiche e sostanze reattive dell’ossigeno (ROS) con gli acidi nucleici possono portare alla rottura dello scheletro strutturale delle basi azotate e a loro modifiche chimiche; lo squilibrio fra la produzione dei ROS e i meccanismi di difesa antiossidanti dell'organismo, a favore della reazioni di ossidazione, viene definito come stress ossidativo. Esso è stato associato alla patogenesi ed al peggioramento di varie malattie, legate principalmente all’età, tra cui infarti, patologie cardiovascolari, malattie neurodegenerative, diabete e invecchiamento precoce. Gli effetti sul DNA rivestono una fondamentale importanza in ambito biomedico in quanto possono generare errori di appaiamento di basi durante la replicazione, risultando potenzialmente mutageni. Tra le basi del DNA e dell’RNA, la guanina è quella più facilmente esposta all’attacco del ROS idrossile, in particolare in posizione 8, mentre la citosina viene metilata in posizione 5. La peculiarità di queste modifiche è quella di impedire l’appaiamento nella replicazione del DNA formando appaiamenti errati. Il presente studio ha come obiettivo la valutazione della correlazione tra uso di sostanze psicoattive e indicatori di metilazione del DNA e danno ossidativo agli acidi nucleici in una popolazione in terapia con metadone, sottoposta a stress sostanza-correlato, in due differenti matrici: urina e saliva. Lo sviluppo della parte sperimentale ha previsto la raccolta di campioni biologici da due popolazioni diverse: 1) per quanto attiene alla matrice urinaria, le analisi sono state svolte su 39 campioni di soggetti deceduti in età adulta, di entrambi i sessi, senza malattie associate a ossidazione o metilazione degli acidi nucleici. Le analisi sono state svolte mediante utilizzo di cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa: i campioni di urina, dopo scongelamento, sono stati centrifugati e diluiti con una soluzione di acido formico in acqua contenente la miscela degli standard interni secondo un rapporto 1:3; 2) la seconda popolazione, da cui sono stati raccolti campioni di fluido del cavo orale, consiste di 66 campioni da soggetti adulti in cura presso il SerDP di Parma e di cui sono state raccolte informazioni socio-anamnestiche riguardo abitudini e stili di vita, dopo opportuno consenso informato e intervista anamnestica - con conseguente donazione volontaria del campione - per l’ analisi strumentale in spettrometria di massa: i campioni di saliva, analizzati con un metodo sviluppato per l’individuazione di biomarkers di stress ossidativi, sono stati preventivamente centrifugati e diluiti con solvente acquoso addizionato di acido formico; la preparazione è basata su due estrazioni con cartucce per estrazione in fase solida (SPE Waters e Oasis), a partire da 200 microlitri di matrice biologica. La preparazione del campione avviene in modo automatizzato con la preparazione di 8 punti di curva di calibrazione e quality controls a diverse concentrazioni.

In questo studio pilota, sono state trovate alcune correlazioni tra biomarkers e sostanze d’abuso su campioni urinari di soggetti deceduti: • analiti come la Creatinina, 5OHMedCyt, Guo, dGuo, e i rapporti tra 8-oxo-Gua/Gua, 5OHMedCyt/Cyto, 8Guo/Guo, 8dGuo/dGuo possono dare un’indicazione sullo stress ossidativo provocato dall’abuso di una o più sostanze: in particolare, i valori di Gua e 5OHMedCyt sembrano essere correlati ad assunzione di tutte le sostanze in modo positivo, tranne che per le benzodiazepine; • 1-MeGua correla positivamente con i soggetti che abusano di morfina, mentre dCyt e 5-MedCyt correlano positivamente esclusivamente con soggetti che fanno abuso di cocaina, morfina e THC. Per quanto riguarda, invece, gli studi in saliva è stata evidenziata un’alta variabilità di 8-oxo-dGuo nei campioni, probabilmente in parte legata al polimorfismo genetico. Inoltre, non è stata riscontrata una correlazione fra età e livelli di 8-oxo-dGuo come singole concentrazioni, bensì con il rapporto 8-oxo-dGuo/contenuto proteico, dimostrando che l’età è un importante fattore interferente in queste misurazioni. Dalle comparazioni eseguite, gli assuntori di cocaina mostrano valori di 8-oxo-dGuo significativamente differenti se comparati ad assuntori di alcol; un trend simile si evidenzia tra i valori di 8-oxo-dGuo di eroinomani se comparati ad assuntori di alcol. Nessuna conclusione statisticamente valida può essere tratta per assuntori di THC poiché i valori associati di 8-oxo-dGuo mostrano elevata varabilità. Questo progetto ha studiato le concentrazioni e correlazioni di un pannello di biomakers indotti ossidativamente in due popolazioni e due matrici diverse, fornendo un contributo alla definizione di valori e delle concentrazioni di tali biomakers. Viene anche dimostrato il ruolo dell’età e del sesso come fattori di interferenza. L’epigenetica della tossicodipendenza e dell’abuso può rappresentare, in tal senso, un approccio molecolare e multidisciplinare per affrontare il problema. Studiare, perciò, l’effetto dell’abuso di droghe sui livelli di metilazione di specifiche regioni del promotore del gene in varie fasi e la manipolazione dell’espressione genica, può portare al livello successivo nella comprensione dei meccanismi epigenetici, aprendo così la strada a nuove frontiere per la ricerca terapeutica ed investigativa.

The interactions of xenobiotics and reactive oxygen substances (ROS) with nucleic acids may lead to the breakdown of the structural skeleton of the nitrogen bases and to their chemical modifications; The imbalance between the ROS production and the inner antioxidant defense mechanisms of the body is defined as oxidative stress. It has been associated with the pathogenesis and worsening of various diseases, mainly related to age, including heart attacks, cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases, diabetes and premature aging. Effects on DNA are of fundamental importance in the biomedical field as they can generate basic pairing errors during replication, resulting in potentially mutagenic results. Among the bases of DNA and RNA, guanine is the most easily exposed to attack of hydroxyl ROS, particularly in position 8, while cytosine is methylated in position 5. The peculiarity of these changes is to prevent pairing in DNA replication by forming wrong pairings. The purpose of this study is to assess the correlation between the use of psychoactive substances and indicators of DNA methylation and oxidative damage to nucleic acids in a population undergoing methadone therapy in urine and oral fluid. The development of the experimental part involved the collection of biological samples from two different populations: 1) as regards the urinary matrix, the analyses were carried out on 39 samples of deceased adults without diseases associated with oxidation or methylation of nucleic acids. The analyses were carried out using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: urine samples, after thawing, have been centrifuged and diluted with formic acid solution in water containing the mixture of internal standards in a 1:3 ratio; 2) the second population, from which samples of oral fluid have been collected, consists of 66 samples from adults treated at the Serdp in Parma and of which socio-anamnestic information has been collected concerning habits and lifestyle, after appropriate informed consent and anamnestic interview – prior to voluntary sample donation - for instrumental analysis in mass spectrometry: oral fluid samples, analysed using a method developed for the detection of oxidative stress biomarkers, have been previously centrifuged and diluted with aqueous solvent with formic acid; the preparation is based on two extractions with solid phase extraction cartridges (SPE Waters and Oasis), starting from 200 microlitres of biological matrix. Sample preparation is automated with the preparation of 8 calibration curve points and quality controls at different concentrations. In this pilot study, correlations were found between biomarkers and substance abuse on urinary samples of deceased subjects as follows: • Analytes such as Creatinine, 5OHMedCyt, Guo, dGuo, and the ratios between 8-oxo-Gua/Gua, 5OHMedCyt/Cyto, 8Guo/Guo, 8dGuo/dGuo may give an indication of oxidative stress caused by the abuse of one or more substances: in particular, the values of Gua and 5OHMedCyt appear to be related to intake of all substances, except for benzodiazepines; • 1-Megua positively correlates with morphine abusers, while dCyt and 5-Medcyt positively correlate exclusively with cocaine, morphine and THC abusers. With regard to oral fluid studies, however, a high variability of 8-oxo-dGuo in samples was noted, probably partly linked to genetic polymorphism. Furthermore, no correlation was found between age and 8-oxo-dGuo levels as individual concentrations, but with the 8-oxo-dGuo/protein ratio, demonstrating that age is an important interfering factor in these measurements. From comparisons made, cocaine users showed significantly different 8-oxo-dGuo values when compared to alcohol users; a similar trend is evident between 8-oxo-dGuo values of heroin users when compared to alcohol takers. No statistically valid conclusion can be drawn for THC takers since the associated values of 8-oxo-dGuo show high variability. This project studied the concentrations and correlations of a panel of oxidatively induced biomakers in two different populations and matrices, providing a contribution to the definition of values and concentrations of these biomakers. The role of age and sex as factors of interference is also investigated. The epigenetics of drug addiction and abuse can be, in this sense, a molecular and multidisciplinary approach to address the problem. Studying, therefore, the effect of drug abuse on methylation levels of specific regions of the gene promoter at various stages and the manipulation of gene expression, can lead to the next level in understanding epigenetic mechanisms, thus paving the way for new frontiers for therapeutic and investigative research.