Analisi bioinformatica sull'origine e l'evoluzione delle famiglie di DNasi1 e 2 nei vertebrati - Caratterizzazione biochimica della DNasi1L2 umana a scopo terapeutico

Abstract

Il genoma dei vertebrati contiene un ricco repertorio di endonucleasi denominate DNasi in grado di degradare il DNA sia in ambiente intra- che extra-cellulare e di svolgere ruoli chiave nel mantenimento dell’omeostasi cellulare. Nell’uomo esistono due famiglie di queste DNasi: la famiglia delle DNasi1 e la famiglia delle DNasi2. La prima comprende DNasi1, DNasi1L1, DNasi1L2, e DNasi1L3, endonucleasi attive a pH neutro e in presenza di ioni metallici che agiscono come cofattori. La seconda famiglia è costituita da DNasi2 e DNasi2b, che sono invece attive a pH acido e in assenza di cofattori. Nonostante l’importanza di questi enzimi, risultano ancora poco chiare le origini e l’evoluzione delle DNasi nei vertebrati. Infatti, non vi è una completa ricostruzione filogenetica di ciascuna famiglia e il significato della diversificazione di questi enzimi non è chiaro. Per questo motivo, sono state investigate l’origine e l’evoluzione delle DNasi nei vertebrati. Le analisi bioinformatiche sono state svolte allo scopo di individuare e classificare tutte le DNasi presenti nei vertebrati, ricostruire l'origine e l'evoluzione delle due famiglie di DNasi1 e 2, e chiarire il significato fisiologico del vasto repertorio delle DNasi nei vertebrati. L’attività endonucleasica della DNasi1 umana è impiegata nella terapia della fibrosi cistica. Attualmente, la DNasi1 prodotta in forma ricombinante (rhDNasi1 o Pulmozyme) è l’agente mucolitico più utilizzato per il trattamento delle complicanze polmonari associate a questa malattia genetica rara. La sua somministrazione per inalazione permette di fluidificare il muco grazie alla degradazione delle fibre di DNA extra-cellulare in esso contenuto. Tuttavia, l'efficacia della rhDNasi1 è compromessa a causa della forte inibizione da actina, della breve permanenza nei polmoni in forma attiva, e della non responsività di alcuni pazienti. Al fine di superare i limiti terapeutici di questo enzima e ampliare il repertorio di agenti mucolitici disponibili, è stato ritenuto utile individuare e caratterizzare dal punto di vista biochimico altre DNasi con proprietà terapeutiche inesplorate. L’attività ottimale a pH acido e la resistenza all’actina mostrate dalla DNasi1L2, rendono questo enzima un valido candidato per una terapia mucolitica alternativa alla rhDNasi1.

The vertebrate genome encodes a rich repertoire of DNases that hydrolyze intra- and extracellular DNA thereby playing key roles in the maintenance of cellular homeostasis. In humans, two families of DNases exist: DNase1 and DNase2. The first includes DNase1, DNase1L1, DNase1L2, and DNase1L3, that are active at neutral pH and require metal ions as cofactors. The second family includes DNase2 and DNase2b, that are active at acidic pH and do not require cofactors. Despite the importance of these enzymes, the origin and evolution of DNases in vertebrates are still unclear. In fact, a complete phylogenetic reconstruction of each family is missing and the significance of the diversification of these enzymes is still unknown. For these reasons, the evolutionary history of vertebrate DNases was investigated in silico by using bioinformatics tools. Analyses were performed with the aim to identify and classify all DNases, reconstruct the origin and evolution of the DNase1 and DNase2 families, and elucidate the physiological significance of this vast repertoire of enzymes. The endonuclease activity of human DNase1 is exploited in the therapy of cystic fibrosis (CF) because of the high DNA content in the mucus of CF patients. Currently, recombinant DNase1 (rhDNasi1 or Pulmozyme) is a widely used mucolytic agent for the treatment of pulmonary complications associated with this rare genetic disease. Although its administration by inhalation allows the fluidification of mucus, the efficacy of rhDNase1 is compromised because of the strong actin inhibition, the short residence time in the lungs, and the non-responsiveness of certain patients. To overcome these limitations and expand the repertoire of mucolytic agents, it is necessary to identify and characterize the enzimatic activity of other DNases with unexplored therapeutic properties. The acidic pH optimum and the actin resistance of DNase1L2 make this enzyme a good candidate for this purpose.