Identificazione di una dipendenza epi-metabolica da EHMT2/G9a in Leucemia linfoblastica acuta a cellule T

Abstract

Introduzione: L'identificazione di geni coinvolti nella metilazione del DNA e nelle modificazioni istoniche post-traduzionali nelle neoplasie ematologiche offre un'opportunità per un nuovo intervento terapeutico, orientato all'inversione o alla modulazione degli eventi epigenetici alla base di queste malattie. Infatti, nella leucemia mieloide acuta (AML) e nelle sindromi mielodisplastiche (MDS) i pattern di metilazione sono alterati da mutazioni nei geni TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A e WT1 e le terapie abbinate hanno dimostrato un'attività clinica promettente. Nella leucemia linfoblastica acuta a cellule T (T-ALL) gli approcci guidati dall'epigenetica non sono ancora ben convalidati, specialmente nell'impostazione recidivante/refrattaria (R/R). In questo progetto, abbiamo cercato di identificare le dipendenze epigenetiche drogabili in T-ALL per anticipare potenziali interventi sinergici in R/R T-ALL. Metodi: Abbiamo sfruttato i risultati di uno screening chimico e shRNA centrato sull'epigenoma per identificare le dipendenze dei modificatori della cromatina in T-ALL. Abbiamo dato la priorità alla proteina conservata lisina H3K9me2-1 metiltransferasi, G9a/EHMT2 in base all'effetto dell'inibizione mirata sulla vitalità cellulare e all'espressione preferenziale nella leucemia rispetto al midollo osseo normale. Abbiamo descritto le conseguenze fenotipiche della perdita di G9a dovuta all'inibizione di piccole molecole o alla soppressione genetica. La preponderanza dei risultati ha indicato un ruolo di G9a nel controllo degli effettori del metabolismo del glicogeno. Lo abbiamo confermato come segue: 1) funzionalmente mediante flussi glicolitici e analisi della disfunzione mitocondriale, 2) trascrizionalmente sovrapponendo un geneset in cui abbiamo soppresso G9a utilizzando piccole molecole o CRISPR/Cas9, con firme GEO del fattore di trascrizione curato per identificare i denominatori comuni della segnalazione G9a. Infine, abbiamo convalidato la nostra ipotesi in scaffold 3D e modelli di xenotrapianti ortotopici di T-ALL. Risultati: Abbiamo identificato EHMT2 come una dipendenza trascrizionale in T-ALL dall'intersezione di uno shRNA e screening chimici entrambi focalizzati sui modificatori epigenetici. Gli inibitori di G9a competitivi e non competitivi, BIX01294, UNC0638 e UNC0642, o la soppressione genetica di G9a riducono la proliferazione di T-ALL portando le cellule in uno stadio apoptotico tardivo. Alle stesse condizioni, il livello di H3K9me2 diminuisce selettivamente rispetto ad altri marcatori epigenetici, suggerendo l'effetto sul bersaglio del fenotipo osservato. Le cellule T-ALL prive di G9a presentano un numero maggiore di vacuoli autofagici contenenti glicogeno. È interessante notare che l'accumulo di glicogeno è sostenuto dall'inattivazione della glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK-3) in più linee cellulari di T-ALL prive di G9a. Successivamente ci siamo chiesti se G9a altera il metabolismo del glucosio e dimostrato una riduzione del consumo di ossigeno durante il trattamento con gli inibitori di G9a, suggerendo che G9a altera l'equilibrio tra glicolisi e gluconogenesi. Coerentemente la mancanza di glucosio, secondaria al trattamento con 2-desossi-d-glucosio (2-DG), salva la formazione di autofagosomi al trattamento con G9a. L'analisi dell'arricchimento trascrizionale della perdita di EHMT2 ha mostrato che il sensore metabolico SESN2 è represso sulla modulazione di G9a e, a sua volta, la perdita di SESN2 riassume l'effetto osservato con l'inibizione di G9a. Infine, abbiamo dimostrato che l'UNC0642 altera la crescita della leucemia sia nello scaffold 3D T-ALL da campioni clinici sia in un modello ortotopico di xenotrapianto di T-ALL in cui la perdita di H3K9me2 è parallela all'effetto antileucemico osservato con questo farmaco. Conclusione: In conclusione, abbiamo identificato G9a come una vulnerabilità epigenetica in T-ALL. Corollario a ciò, abbiamo descritto un ruolo di G9a nel controllo di un circuito metabolico con SESN2 e GSK-3 come effettori a valle di una morte cellulare autofagica.

Background: The identification of genes involved in DNA methylation and post- translational histone modifications in hematologic malignancies offers an opportunity for novel therapeutic intervention, geared towards reversing or modulating epigenetic events underpinning these diseases. In fact, in acute myeloid leukemia (AML) and myelodysplastic syndromes (MDS) methylation patterns are altered by mutations in TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A, and WT1 genes and matched therapies have demonstrated promising clinical activity. In T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) the epigenetic driven approaches are not yet well validated, especially in the relapsed/refractory (R/R) setting. In this project, we sought to identify druggable epigenetic dependencies in T-ALL to anticipate potential synergistic interventions in R/R T-ALL. Methods: We leveraged the results of a chemical and an epigenome-centered shRNA screen to identify chromatin modifier dependencies in T-ALL. We prioritized the conserved protein lysine H3K9me2-1 methyltransferase, G9a/EHMT2 based on the effect of targeted inhibition on cell viability and the preferential expression in leukemia vs. normal bone marrow. We described the phenotypic consequences of G9a loss due to small molecule inhibition or genetic suppression. The preponderance of results pointed to a role of G9a in the control of effectors of glycogen metabolism. We confirmed this as follows:1) functionally by glycolytic fluxes and mitochondrial dysfunction analysis, 2) transcriptionally by overlapping a geneset in which we suppressed G9a using small molecules or CRISPR/Cas9, with curated transcription factor GEO signatures to identify common denominators of G9a signaling. Finally, we validated our hypothesis in 3D scaffolds and orthotopic xenograft T-ALL models. Results: We identified EHMT2 as a transcriptional dependency in T-ALL by the intersection of a shRNA and chemical screens both focused on epigenetic modifiers. Competitive and non-competitive G9a inhibitors, BIX01294, UNC0638 and UNC0642, or genetic G9a suppression decreases T-ALL proliferation drifting the cells into a late apoptotic stage. At the same conditions, the level of H3K9me2 selectively decreases compared to other epigenetic markers, suggesting the on-target effect of the observed phenotype. G9a deprived T-ALL cells present with an increased number of autophagic vacuoles containing glycogen. Interestingly glycogen accumulation is sustained by the inactivation of Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK-3) in multiple G9a null T-ALL cell lines. We next asked whether G9a alters glucose metabolism and demonstrated a reduction of oxygen consumption upon G9a inhibitors treatment suggesting that G9a alters the balance between glycolysis and glycogenesis. Consistently the lack of glucose, secondary to 2-deoxy-d-glucose (2-DG) treatment rescues the formation of autophagosomes upon G9a treatment. Transcriptional enrichment analysis of EHMT2 loss showed that the metabolic sensor SESN2 is repressed upon G9a modulation, and in turn, loss of SESN2 recapitulates the effect seen with G9a inhibition. Finally, we demonstrated that UNC0642 impairs leukemia growth both in 3D scaffold T-ALL from clinical samples and in a T-ALL xenograft orthotopic model where the loss of H3K9me2 parallels the antileukemia effect seen with this drug. Summary/Conclusion: In conclusion, we identified G9a as an epigenetic vulnerability in T-ALL. Corollary to this, we described a role of G9a in the control of a metabolic circuitry with SESN2 and GSK-3 as downstream effectors of an autophagic cell death.