Esaurimento funzionale dei linfociti T CD8 nell’epatite cronica B: caratterizzazione di un network di funzioni intracellulari deregolate la cui correzione induce ripristino della funzione antivirale

Abstract

L’attuale terapia per l’epatite cronica B si basa principalmente sulla somministrazione di farmaci antivirali con analoghi nucleos(t)idici (NUC), i quali spesso devono essere dispensati per tutta la vita per evitare la possibile riattivazione del virus. Per questo motivo è necessario individuare un trattamento in grado di ridurre la durata delle attuali terapie. In quest’ottica, la ricostituzione della funzionalità T linfocitaria anti-virale è considerata una strategia potenziale in quanto, durante la fase cronica dell’infezione, i linfociti T CD8 perdono progressivamente le loro funzioni in un processo noto come “exhaustion linfocitaria”. Nel nostro laboratorio abbiamo precedentemente svolto uno studio di analisi trascrittomica, allo scopo di individuare direttamente nei linfociti T CD8 HBV-specifici isolati da pazienti con infezione cronica le alterazioni funzionali associate alla persistenza virale. I dati raccolti hanno evidenziato una prevalente down-regolazione di geni coinvolti in diverse funzioni cellulari, tra cui quelle più significative erano relative a vari processi mitocondriali, alla proteostasi, alla risposta al danno del DNA e al controllo epigenetico della trascrizione. Alcuni di questi aspetti sono stati ulteriormente indagati funzionalmente, dimostrando un’alterazione mitocondriale, con produzione di elevati livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e una ridotta proteostasi, con accumulo di aggregati proteici intracellulari. Chiarire come i difetti riscontrati siano meccanicisticamente interconnessi è centrale per fare luce sulla patogenesi dell’exhaustion T linfocitaria e per disegnare nuovi interventi efficaci di immunomodulazione per l’epatite B cronica. A questo fine, nel presente lavoro abbiamo inteso verificare se l’elevato contenuto di ROS provochi un aumento del danno del DNA nei linfociti T CD8 HBV-specifici exhausted, e investigare se la disfunzione della risposta al danno del DNA, emersa dalla precedente analisi trascrizionale, può rappresentare un target per una strategia mirata di recupero della funzionalità T linfocitaria. Studi di letteratura, effettuati in modelli di senescenza cellulare, indicano l'associazione di accumulo di danno del DNA e attivazione persistente di meccanismi di risposta al danno. Tra questi, gli enzimi NAD-dipendenti della famiglia delle poli-ADP-ribosilasi (PARP) catalizzano la formazione di catene di poli-ADP-ribosio in corrispondenza della lesione del DNA, allo scopo di reclutare altri mediatori della risposta al danno, con la conseguente diminuzione dei livelli cellulari di NAD. Per studiare se questo modello possa rappresentare un meccanismo alla base della disfunzione dei linfociti T CD8 virus-specifici nell’epatite cronica B sono stati analizzati i possibili “consumatori” cellulari di NAD e l’effetto della supplementazione di NAD sul ripristino della funzionalità T linfocitaria. I linfociti T CD8 HBV-specifici di pazienti affetti da epatite cronica B presentano un elevato accumulo di danno del DNA e disfunzione di meccanismi di risposta al danno, che comprendono livelli di poli-ADP-ribosilazione più bassi rispetto ai controlli. La somministrazione di NAD esogeno permette il miglioramento significativo della funzionalità degli enzimi PARP specificamente nelle cellule dei pazienti con epatite cronica, suggerendo che una carenza di NAD a livello intracellulare può essere una causa della disfunzione linfocitaria. Inoltre l’enzima CD38, noto per essere il maggior consumatore di NAD intracellulare, è risultato sovra-espresso nelle cellule HBV-specifiche dei pazienti cronici, come ulteriore effettore della deplezione di NAD. Di conseguenza, è stato testato in vitro un precursore nel NAD, la Nicotinamide Mononucleotide (NMN), per verificarne la capacità nel ripristinare i pathway cellulari disfunzionali individuati in precedenza. I risultati hanno confermato che l’uso di NMN è in grado di migliorare la funzionalità mitocondriale, la risposta al danno del DNA, la proteostasi cellulare, l’acetilazione istonica e potenziare la funzionalità T linfocitaria antivirale. Effetto questo ulteriormente potenziato dall’aggiunta di un inibitore dell’attività di CD38. In conclusione, i dati qui esposti delineano un modello di exhaustion dei linfociti T CD8 virus-specifici, in cui diversi difetti intracellulari interconnessi, compresa una diminuzione della lunghezza dei telomeri, sono causalmente associati alla deplezione di NAD, suggerendo similarità tra il fenomeno dell’exhaustion e della senescenza cellulare. Una terapia incentrata sul ripristino del pool cellulare di NAD potrebbe quindi rappresentare una strategia idonea alla ricostituzione della risposta T linfocitaria nei pazienti affetti da epatite cronica B.