Functional and molecular analysis of Organic Cation Transporters (OCT/OCTN) in human airway epithelial cells

Abstract

La famiglia genica SLC22 include i trasportatori OCTs (Organic Cation Transporters ) e OCTNs (Organic Cations and Zwitterions Transporters) che, presenti sulla membrana plasmatica delle cellule umane, traslocano una vasta gamma di composti endogeni di importanza fisiologica tra cui neurotrasmettitori, colina, carnitina, coenzimi ed anche numerosi farmaci. A tutt’oggi, gli studi effettuati sugli OCTs/OCTNs nelle vie aeree umane sono stati principalmente condotti su linee cellulari bronchiali o alveolari, immortali o trasformate. Nel mio progetto abbiamo studiato l’attività di questi trasportatori in modelli primari umani di cellule epiteliali delle vie aeree. A questo scopo sono stati utilizzati due modelli organotipici 3D in vitro, precisamente le EpiAirwayTM, un modello di cellule tracheali-bronchiali umane, e le EpiAlveolarTM, un sistema di epitelio alveolare composto da cellule epiteliali alveolari, cellule endoteliali polmonari e fibroblasti. Per mimare meglio le condizioni in vivo, entrambi i modelli sono stati coltivati in condizioni di interfaccia aria-liquido (Ali, Air Liquid Interface). Inoltre, la linea cellulare bronchiale Calu-3, uno dei modelli di riferimento in studi di permeabilità a farmaci, è stata utilizzata come confronto. L'attività dei trasportatori OCTs e OCTNs è stata valutata misurando rispettivamente l'uptake di 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+) e di L-carnitina, sia sul lato apicale che basolaterale dei monostrati cellulari. L'espressione genica e proteica di questi trasportatori è stata determinata attraverso misure del numero di molecole di mRNA in RT-PCR quantitativa ed attraverso analisi Western Blot. In parallelo, è stata inoltre valutata l'attività e la funzione del trasportatore ATB0,+ (codificato da SLC6A14), in quanto tale trasportatore accetta, oltre agli amminoacidi neutri e cationici, anche la carnitina. Infine è stata studiata l'interazione dei trasportatori con farmaci broncodilatatori anticolinergici. I risultati ottenuti hanno dimostrato che nelle EpiAirwayTM: - Sia OCT1 che OCT3 sono espressi e funzionali solo sulla membrana basolaterale - Il trasportatore OCTN2 è espresso e funzionale sul lato basolaterale. Questo risultato è stato supportato dall'analisi immunocitochimica che ha dimostrato una distribuzione laterale della proteina sia nelle Calu-3 che nelle EpiAirwayTM - ATB0,+ è marcatamente espresso e funzionale solo a livello apicale, come anche confermato nei quadri di analisi immunocitochimiche. - I broncodilatatori glicopirrolato e tiotropio interagiscono apicalmente con ATB0,+, mentre l'ipratropio interagisce con OCTN2 e gli OCTs sulla membrana basolaterale. - Stimoli infiammatori, quali LPS o TNFα, causano un'induzione dell'espressione e dell'attività di SLC6A14/ATB0,+. Le stesse analisi effettuate nelle EpiAlveolar™ rivelano che questi due modelli cellulari (EpiAirway™ ed EpiAlveolar™) mostrano strette somiglianze in termini di espressione ed attività di questi trasportatori ed anche di interazione con i farmaci, suggerendo che bronchi ed alveoli condividono lo stesso fenotipo. In conclusione, l'identificazione di questi trasportatori nell’epitelio respiratorio umano può aprire nuovi campi di indagine negli studi di farmacocinetica che si occupano della inalazione dei farmaci e del rilascio polmonare.

Human transporters belonging to the solute carrier family 22 (SLC22) play a central role in physiology, pharmacology, and toxicology because of the broad spectrum of endogenous metabolites, drugs, and toxins that they can move across cell plasma membranes. The human SLC22 family includes Organic Cation Transporters (OCTs) that operate as electrogenic uniporters for organic cations and “Novel” Organic Cation Transporters (OCTNs) mediating Na+-cotransport of selected zwitterions. The studies addressing OCTs/OCTNs in human airways were mostly performed in immortal or transformed cell lines; here, we studied organic cation transporters in primary models of human airways epithelial cells. To this purpose, EpiAirway™, a 3D organotypic in vitro model of human tracheal-bronchial cells, and EpiAlveolar™, a model of alveolar epithelium, were employed. To better reflect the proper in vivo-like conditions both cellular models were grown under Air Liquid Interface (ALI) condition. Calu-3 bronchial cell line was used in parallel for comparison, as a widely employed model in studies of drugs permeability. The activity of OCTs and OCTNs was evaluated by measuring the uptake of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) and L-carnitine, respectively, both at the apical and basolateral side of monolayers. Gene and protein expression of these transporters was determined by measuring the number of mRNA molecules through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) and Western Blot analysis. In addition the activity and function of ATB0,+ Transporter (coded by SLC6A14), was evaluated since this transporter accepts also carnitine, beside neutral and cationic amino acids. The interaction of the transporters with drugs, such as bronchodilators, was also assessed. Results obtained demonstrated that in EpiAirway™: - Both OCT1 and OCT3 are expressed and functional only on the basolateral membrane - OCTN2 transporter is expressed and functional at the basolateral side. This result was supported by the immunocytochemical analysis demonstrating a lateral distribution of the protein both in Calu-3 cell and in EpiAirway™ - ATB0,+ is markedly expressed and functional only at the apical side. The protein was clearly present on this side of the membrane in immunocytochemical images - The bronchodilators glycopyrrolate and tiotropium interact with ATB0,+ on the apical membrane, while ipratropium with OCTN2 and OCTs on the basolateral membrane. - Inflammatory stimuli, such as LPS or TNFα, cause an induction of the expression and activity of ATB0,+ . The same analysis performed in EpiAlveolar™ reveal that EpiAirway™ and EpiAlveolar™ display close similarities in terms of transporters expression and interaction with drugs. In conclusion, the identification of these transporters in these models of human epithelial airways can open new fields of investigation in the study of drug inhalation and pulmonary delivery.