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Title: Set-up and characterization of an iPSC-derived neurocardiac co-culture model
Other Titles: Sviluppo e caratterizzazione di un modello di co-cultura neurocardiaca derivato da iPSC
Authors: Cattelan, Giada
Issue Date: 2022
Publisher: Università degli studi di Parma. Dipartimento di Medicina e chirurgia
Document Type: Doctoral thesis
Abstract: Il sistema nervoso autonomo (ANS) regola la frequenza cardiaca, la velocità di conduzione, la forza di contrazione, la coesione dei miociti e il rilassamento del cuore. La delucidazione di come l'ANS e il sistema cardiaco interagiscono e cooperano è alla base della comprensione dei meccanismi che partecipano allo sviluppo di diverse malattie cardiache. Lo scopo di questa tesi è quello di sviluppare un modello cellulare neurocardiaco in vitro adatto allo studio dell'interazione tra l'ANS e il cuore. Per raggiungere questo obiettivo, sono state utilizzate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). In questo lavoro, cardiomiociti (CMs) derivati da iPSC e neuroni simpatici (SNs) derivati da iPSC sono stati prodotti a partire dalla stessa linea di iPSC. I CMs derivati da iPSC mostrano un'attività di battito spontaneo ed esprimono i tipici marcatori cardiaci come l'α-actinina, la troponina I e la catena pesante della miosina 7, come evidenziato dall'analisi genica e proteica. I SNs derivati da iPSC, ottenuti riproducendo un protocollo disponibile in letteratura, sono stati caratterizzati dettagliatamente mediante RT-PCR, citometria a flusso, Western Blot, immunofluorescenza e analisi con MEA. I risultati hanno confermato la derivazione di cellule appartenenti al lineage neuronale simpatico, mostrando l'espressione dei marcatori noradrenergici PHOX2B, TH e DBH. Le cellule caratterizzate sono state poi impiegate per la creazione di un modello neurocardiaco. Le condizioni di co-cultura sono state ottimizzate a partire dalla composizione del mezzo, la densità delle cellule, la strategia di coating e la distribuzione spaziale. Dopo 3-5 giorni di co-cultura con CMs, i SNs derivati da iPSC formano prolungamenti degli assoni TH-positivi verso la popolazione cardiaca, mostrando positività anche per il marcatore Synapisin, intorno alla formazione di connessioni con CMs derivati da iPSC. Esperimenti funzionali preliminari sembrano indicare che la presenza di SNs derivati da iPSC inducano all' aumento del battito dei CMs derivati da iPSC quando coltivati insieme per un periodo di due settimane. Lo sviluppo di questo metodo di co-cultura e le osservazioni preliminari effettuate, forniscono un promettente modello cellulare in vitro per un'indagine più profonda dell'interconnessione neurocardiaca e per delucidazioni future nello sviluppo di modelli di molti disturbi cardiaci.
The autonomic nervous system (ANS) regulates the heart rate, conduction velocity, force of contraction, myocyte cohesion and relaxation of the heart. The elucidation of how ANS and the cardiac system interact and cooperate is at the basis of the comprehension of the mechanisms that participate in the development of many different cardiac diseases. The aim of this thesis is to develop an in vitro neurocardiac cell-model suitable for the study of the interaction between the ANS and the heart. To achieve this aim, induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) were used. In this work, iPSC-derived CMs and iPSC-derived SNs were produced starting from the same line of iPSCs. The obtained iPSC-derived CMs showed spontaneous beating activity and expressed typical cardiac markers such as α-actinin, troponin I and myosin heavy chain 7, as evident by gene and protein analysis. iPSC-derived SNs, obtained reproducing a protocol available in literature, were in depth characterized by RT-PCR, Flow cytometry, Western Blot, immunofluorescence and multi electrode array analyses. The results confirmed the derivation of sympathetic neuronal lineage cells, showing the expression of the noradrenergic markers Paired-like homeobox 2b, Tyrosine Hydroxylase and Dopamine Beta Hydroxylase. The characterized cells were then employed for the creation of a neurocardiac model. The co-culture conditions were optimized including medium composition, cell densities, coating strategy and spatial distribution. After 3-5 days of co-culture with CMs, iPSC-derived SNs formed TH-positive axonal prolongation toward the cardiac population and showed positivity for the marker Synapisin, where connections with iPSC-derived CMs were formed. Preliminary functional experiments seem to indicate that the presence of iPSC-derived SNs might increase the beating rate of iPSC-derived CMs when co-cultured for a period of two weeks. The establishment of this co-culture methodology and the preliminary observations provide a promising in vitro cell model for a deeper investigation of the neurocardiac interconnection and future insights in the modelling of many cardiac disorders.
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