Ruolo dell'ipossia nel differenziamento condrocitario: applicazioni nella medicina rigenerativa.

Abstract

Il presente studio sperimentale ha avuto l'obiettivo di studiare e capire se, e in che misura, l'ipossia e i fattori dipendenti da essa, in particolare HIF-1alpha, potessero influenzare il differenziamento condrocitario in vitro. Per tali indagini, espianti di cartilagine sono stati ottenuti dall'articolazione metacarpo- e metatarso-falangea (articolazione del nodello) di arti di equino prelevati in macello. L'espianto è stato fatto esclusivamente da articolazioni senza segni di artropatia o Wdegenerazionecartilaginea per prevenire alterazioni nell'espressione genica dovute a una condizione patologica dei condrociti. I condrociti isolati sono stati successivamente coltivati in due diversi sistemi colturali: 1) in adesione su plastica (sistema bidimensionale) e 2) all'interno di sfere ("beads") di idrogel di alginato di sodio (sistema tridimensionale). Entrambe le tipologie colturali sono state coltivate in quattro differenti condizioni: 1) in D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) con siero fetale bovino al 10% mantenuto in normossia (20% di Ossigeno) (+FCSN); 2) D-MEM con siero fetale bovino al 10% mantenuto in ipossia (5% di Ossigeno) (+FCSI); 3) D-MEM senza siero fetale bovino mantenuto in normossia (-FCSN); 4) D-MEM senza siero fetale bovino mantenuto in ipossia (-FCSI). Le colture sono state così incubate per due settimane. Al termine di tale periodo dalle cellule è stato estratto l’RNA messaggero (mRNA) e quindi è stata eseguita l’analisi molecolare per valutare l’espressione dei markers condrocitari, tramite Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). Le analisi comprendevano i seguenti markers differenziativi: Collagene tipo II (COLL2), Aggrecano (ACAN), Fattore ipossia inducibile (HIF-1alpha, SOX9 (SRY-box transcription factor 9); e i seguenti markers de-differenziativi: Collagene tipo I (COLL1) e Runx2 (RUNX family transcription factor 2). I risultati ottenuti dalle analisi effettuate sono stati confrontati mediante Test t di Student per evidenziare le differenze statisticamente significative con un livello di significatività inferiore al 5% (p<0,05). Dal confronto dei due sistemi colturali si è riscontrata una maggiore espressione dei markers de-differenziativi nei condrociti seminati in adesione e una maggiore espressione di quelli differenziativi in quelli seminati in beads. In generale, l’ipossia indipendentemente dai sistemi colturali, riduce i markers di de-differenziamento e mantiene/aumenta i markers fenotipici del condrocita. La condizione che maggiormente ha favorito l’espressione genica tanto in adesione, quanto in beads è stata quella in ipossia in terreno con FCS10%. Di particolare rilievo è l’espressione di COLL2, estremamente elevata, e di COLL1, praticamente non espresso in beads in nessuna condizione. Anche HIF-1alpha e Sox-9, fattore ad esso correlato, hanno avuto un’espressione maggiore nelle colture in beads, suggerendo che la loro espressione sia strettamente influenzata dall’ipossia e che essa sia necessaria per mantenere il differenziamento condrocitario. I risultati ottenuti mettono in evidenza che un sistema di coltura in vitro mantenuto in ipossia stimola maggiormente l’espressione genica di HIF-1alpha da parte dei condrociti e la sua maggiore espressione sarebbe associata positivamente all’espressione di markers specifici del fenotipo condrocitario, in particolare COLL2, Aggrecano e SOX9. I dati ottenuti, seppur preliminari, contribuiscono a spiegare in che modo l’ipossia, pur associata ad altri fattori, favorisca il mantenimento del fenotipo condrocitario; l’ipossia, infatti, stimola l’aumento dell’espressione di HIF-1alpha, fattore di trascrizione che regola l’aumento di espressione di altri fattori di trascrizione implicati nell’ l’attivazione di pathway necessari alla differenziazione e al mantenimento energetico e metabolico del condrocita.

The experimental study aims at trying to understand if and how hypoxia and other elements related to it, especially HIF-1alpha, could influence the chondrocyte differentiation in vitro. For the experiments, we selected samples of articular cartilage from fetlock joints of properly slaughtered horses Samples and explant of articular cartilage were obtained only from joints with no signs of arthropathy or cartilage degeneration, to prevent alteration in genic expression caused by a pathological condition. Isolated chondrocytes were then seeded in two different methods of culture: adhesion culture on plastic (bidimensional system) and chondrocytes cultured into beads of hydrogel of sodium alginate (tridimensional system). Independently to different types of culture, chondrocytes were cultured in D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) medium in four different conditions: 1) D-MEM with bovine’s fetal serum (FCS) at 10% maintained in normoxia (20% of Oxygen) (+FCSN); 2) D-MEM with bovine’s fetal serum (FCS) at 10% maintained in hypoxia (5% of Oxygen) (+FCSI); 3) D-MEM without bovine’s fetal serum (FCS) maintained in normoxia (-FCSN); 4) D-MEM without bovine’s fetal serum (FCS) maintained in hypoxia (+FCSI). At the end of two weeks of culture mRNA was extracted from the cells, and molecular analyses Real Time PCR method (Polymerase Chain Reaction) was performed to evaluate the following chondrocyte differentiation markers: collagen II (COLL2); Aggrecano (ACAN); Hypoxia inducible factor (HIF-1alpha); Sox9 (SPY-box transcription factor 9); and the following dedifferentiation markers: collagen I (COLL1) and Runx (RUNX family transcription factor 2). The results were compared throughout a Test t Student to highlight some statistical differences, with a significant level cutoff under 5% (p<0,05). When comparing the two cultivation systems, we’ve noticed a higher expression of de-differentiation markers on chondrocytes seeded in adhesion and a higher expression of the differentiation markers in ones seeded in beads. Generally, independently to different colture systems, hypoxia reduced de-differentiation markers ed maintained the chondrocyte differentiastion markers. The condition with hypoxia and FCS10% mostly supported the genic expression, both in adhesion and beads. Particularly relevant was the expression of COLL2, extremely high and the expression of COLL1, non-detectable in all bead’s conditions. Furthermore, the HIF-1alpha and Sox-9 appear related factors and have a higher expression in cells cultured in beads, suggesting that their expression should be closely influenced by hypoxia, which is necessary to maintain the differentiation of chondrocytes. The obtained results have showed that an in vitro culture maintained in hypoxia and with FCS upregulate gene expression of HIF-1alpha in chondrocytes. Its major expression would be positively related to expression of other specific markers of chondrocyte phenotype, particularly COLL2, aggrecan and Sox9. These results can contribute to explain how hypoxia, associated at some other factors, could support the maintenance of chondrocyte phenotype. Indeed, hypoxia stimulates the expression of HIF-1 and other transcription factors and the activation of pathways useful for the differentiation and for the energetic and metabolic maintenance of chondrocyte. We discussed results making comparison with related recent studies found in literature. This was made to underline the analogies of the results we obtained, but also to show eventual limits of the present study and to present advice for the future analyses.