Secretoma di Cellule Staminali Mesenchimali in Medicina Veterinaria: preparazione e valutazione in vitro di effetti biologici su cellule di cavallo

Abstract

Mesenchymal Stem Cells (MSCs) represent a promising approach to cellular therapy in regenerative medicine. In facts, thanks to their multilineage differentiation potential, their immunomodulatory properties and angiogenic characteristics, MSCs play a key role in tissue reparation and regeneration in various degenerative and inflammatory diseases. In veterinary medicine, the horse represents one of the most studied species in regenerative medicine. In this species, MSCs-based therapies are mainly used for the treatment of musculoskeletal diseases like, for example, osteoarthritis and tendinopathies, frequent disorders in these animals. Despite promising results obtained in experimental and clinical studies, MSCs therapeutic applications remain seriously limited by the presence of several safety and efficacy issues of such treatments, mainly related to the in vivo implantation of an active and proliferating cell population. In recent years, various scientific works have been focused on the study and characterization of a new “cell-free” product: MSCs-derived secretome. Secretome is a complex and rich mixture of bioactive molecules released into the extracellular space, which includes different soluble factors, such as growth factors, cytokines, chemokines and components of the extracellular matrix, and insoluble extracellular vesicles, such as exosomes, microvesicles and apoptotic bodies. In literature, several studies show that the therapeutic efficacy of secretome is similar to that obtained with the administration of MSCs. However, the use of secretome offers many biological and practical advantages: once isolated from MSCs conditioned medium, secretome can be more easily standardized and characterized as a “cell-free” product. 8 Based on these premises, Bari and colleagues (Bari et al., 2018) have recently presented an innovative and GMP-compliant procedure for large-scale production of lyosecretome, a pharmaceutical product based on secretome derived from ATMSCs (Adipose Tissue derived MSCs), freeze-dried and ready-to-use, potentially able to replace stem cell therapies in regenerative medicine. The aim of this thesis was, firstly, to evaluate the possibility of producing conditioned medium derived from both canine and equine AT-MSCs, from which obtain lyosecretome, thanks to the collaboration with the group of Maria Luisa Torre (Department of Pharmaceutical Sciences of the University of Pavia). Subsequently, the in vitro biological effects of lyosecretome on equine cells were evaluated, using MSCs derived from adipose tissue and synovial fluid as experimental models, as well as tenocytes and chondrocytes. In this regard, cells were isolated and cultivated from horse tissues taken from slaughterhouses; subsequently, cells were tested with different concentrations of lyosecretome to exclude any cytotoxic effects and assess its ability to maintain the in vitro cellular replication, in comparison with the medium containing fetal bovine serum, the most widely used supplement in cell cultures. The results of the experiments of cytotoxicity and cell viability (cyto-compatibility) showed that equine lyosecretome could replace fetal bovine serum, demonstrating different potency depending on the cellular type analyzed. Results provide the basis for the in vivo application of lyosecretome derived from equine MSCs, assessing the long-term efficacy and safety in animals with naturally occurring pathologies, where such treatments can represent an innovative regenerative therapy. Le Cellule Staminali Mesenchimali (MSCs) rappresentano un promettente approccio di terapia cellulare in medicina rigenerativa; infatti, grazie al loro potenziale differenziativo multi-lineage, alle loro proprietà immunomodulanti e alle caratteristiche angiogeniche, le MSCs svolgono un ruolo chiave nella riparazione e rigenerazione tissutale in diverse patologie degenerative e infiammatorie. In ambito veterinario, il cavallo rappresenta una delle specie più studiate in medicina rigenerativa. In questa specie, le terapie a base di MSCs vengono utilizzate soprattutto per il trattamento di patologie muscoloscheletriche quali, ad esempio, osteoartrite e tendinopatie, disordini frequenti in questi animali. Nonostante i promettenti risultati ottenuti in studi sperimentali e clinici, le applicazioni terapeutiche di MSCs rimangono tuttora fortemente limitate dalla presenza di diverse problematiche relative a sicurezza ed efficacia di tali trattamenti, principalmente legate all’impianto in vivo di una popolazione cellulare attiva e proliferante. Negli ultimi anni, numerosi lavori scientifici sono stati dedicati allo studio e alla caratterizzazione di un nuovo prodotto “cell-free”: il secretoma derivante dalle MSCs. Il secretoma è un complesso e ricco insieme di molecole bioattive rilasciate nello spazio extracellulare, che comprende diversi fattori in forma solubile, ovvero principalmente fattori di crescita, citochine, chemochine e componenti della matrice extracellulare, e vescicole extracellulari in forma insolubile, ovvero esosomi, microvescicole e corpi apoptotici. In letteratura, diversi studi dimostrano che l’efficacia terapeutica del secretoma è simile a quella ottenuta con la somministrazione di MSCs. L’utilizzo del secretoma, tuttavia, offre diversi vantaggi, sia dal punto di vista biologico, che dal punto di vista pratico; una volta isolato dal medium di coltura delle MSCs, il secretoma può essere più facilmente standardizzato e caratterizzato in quanto prodotto “cell-free”. Basandosi su queste premesse, Bari e colleghi (Bari et al., 2018), hanno recentemente presentato una procedura innovativa e conforme alle norme GMP (Good Manufacturing Practice) per la produzione su larga scala del liosecretoma, ovvero un prodotto farmaceutico a base di secretoma derivante da MSCs di tessuto adiposo (AT-MSCs), in forma liofilizzata e pronto per l’utilizzo, potenzialmente in grado quindi di rimpiazzare le terapie a base di cellule staminali nella medicina rigenerativa. L’obiettivo del presente lavoro di tesi è stata, in primo luogo, la valutazione della possibilità di produrre medium condizionato derivante da AT-MSCs di cane e di cavallo, da cui successivamente ottenere il liosecretoma, grazie alla collaborazione con il gruppo di Maria Luisa Torre (Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università di Pavia). Successivamente, sono stati valutati gli effetti dell’esposizione di cellule di cavallo a liosecretoma omologo, utilizzando come modello sperimentale MSCs derivanti da tessuto adiposo e fluido sinoviale, oltre a tenociti e condrociti. A tal proposito, le cellule sono state isolate e coltivate a partire da tessuti di cavallo prelevati in sede di macello; successivamente, le cellule sono state testate con diverse concentrazioni di liosecretoma per escludere eventuali effetti citotossici del preparato e valutare la sua capacità di mantenere in vitro la replicazione cellulare, in confronto con il medium contenente siero fetale bovino, il supplemento più utilizzato nelle colture cellulari. I risultati degli esperimenti di citotossicità e vitalità cellulare (cito-compatibilità), hanno dimostrato che il liosecretoma di cavallo è in grado di sostituire il siero fetale bovino, dimostrando una potenza variabile in funzione del tipo cellulare analizzato. I risultati ottenuti permettono di porre le basi per l’applicazione del liosecretoma derivato da MSCs di cavallo in vivo, valutandone l’efficacia e la sicurezza a lungo termine in animali con patologie naturali spontanee, in cui tale trattamento può rappresentare un’innovativa terapia rigenerativa.