Heterogeneity of the exhausted hbv-specific cd8 t cell population as defined by functional/phenotypic profiling

Abstract

Chronic hepatitis B virus (HBV) infection represents a public health problem worldwide with approximately 250 million people chronically infected at increased risk of developing liver cirrhosis and cancer. Currently available antiviral treatments for chronic HBV infection are based on nucleos(t)ide analogues (NUC), which efficiently suppress viral replication but frequently require a lifelong administration and have limited effect on HBsAg concentrations, and on interferon alpha (IFN), which induces a sustained off-treatment viral suppression in only a minority of patients and is associated with severe side effects. Therefore, the development of new antiviral strategies to provide durable HBsAg loss with limited treatment duration is highly needed. During chronic HBV infection, virus-specific T lymphocytes are poorly responsive to antigenic stimulation and their responses are deeply dysfunctional. This functional impairment is the consequence of different inhibitory mechanisms, including the persistent exposure to high antigen loads, and the resulting exhaustion state is widely believed to contribute to viral persistence. Therefore, functional T cell reconstitution strategies represent possible candidates for the development of novel cure strategies with finite duration of treatment to improve the management of chronic patients and the prevention of HBV-associated hepatic complications. Available data from mouse and other human models of chronic virus infection indicate that exhausted virus-specific CD8 T cells are a heterogeneous dysfunctional population composed of variably differentiated subsets with different response to checkpoint blockade. In order to further characterize this phenomenon in HBV infection, we assessed how heterogeneous are exhausted HBV-specific T cells in chronic HBV patients and whether the analysis of exhausted CD8 T cell subsets co-existing in individual chronic patients can be helpful to predict response to immune modulators. For this purpose, a molecular characterization of T cell exhaustion in the HBV-specific T cell population in CHB patients was conducted by assessing the co-expression of transcription factors, co-inhibitory receptors and differentiation molecules (e.g. PD1, CD39, TOX, CD127, Bcl-2 and TCF1) that allowed to distinguish T cell subsets with different antiviral activity in different cohorts of CHB patients. In particular, co-expression levels of the inhibitory receptor PD-1 and the T cell memory-related marker CD127 distinguished three different T cell subsets: a PD1high CD127low/- cell subset selectively prevalent in naïve viremic patients; a PD1high and CD127high subset present in both CHB and in spontaneous resolver patient cohorts, irrespective of the clinical condition and the level of virus control; a PD1low/- CD127high subset associated with a more protective role in consideration of the preferential detection in patients who spontaneously controlled infection. To confirm that the prevalence of the PD1low/- and CD127high over CD127high CD127low/- subset in individual patients is an indication of better protection, T cell cytokine production was assessed in the different groups of patients. Total ex vivo cytokine levels (IFN- and TNF-) were significantly lower in chronic patients as compared to resolvers and also to flu-specific CD8 cells. The PD1highCD127low/- T cell subset was less efficient than the PD1low/-CD127high subset in terms of total cytokine production. Moreover, cytokine production by PD1low/-CD127high cells was similar in chronic patients and in NUC resolvers and subjects with spontaneous seroconversion. This phenotypic and functional T cell characterization allowed the identification of a distinctive CHB patient cohort with features more similar to resolved patients. To improve the predictive capacity of these profiles, other markers were studied. The PD-1highCD127low/- cells showed a significant correlation with the levels of the ecto-nuclease CD39, which leads to the generation of immune suppressive adenosine. On the other hand, the anti-apoptotic marker Bcl-2 and the memory-related transcription factor TCF1 were highly expressed within the CD127high subsets in both chronic and spontaneously resolved patients. Accordingly, the HMG-box exhaustion-associated transcription factor TOX displayed significantly higher expression in the more impaired PD1high CD127low/- cell subset in comparison with the less dysfunctional PD1low/- CD127high T cell subpopulation in chronically infected patients. The relative predominance of more or less exhausted T cell subsets seems to dictate the level of functional efficiency of the overall anti-viral CD8 T cell population and those patients who harbor a less inhibited virus-specific immune system with predominance of less exhausted CD8 T cell subsets may represent a CHB patient cohort with a better chance of response to immune modulatory interventions. This novel pathogenetic information could be applied for the development of future immune reconstitution strategies to cure HBV infection and to better monitor the results obtained with new anti-viral compounds.

Il virus dell’epatite B (HBV) rappresenta uno dei principali problemi di salute pubblica a livello globale. L'attuale terapia antivirale per l'infezione cronica da HBV si basa sul trattamento con interferone alfa peghilato (PEG-IFN-) a durata definita o sulla somministrazione a lungo termine di analoghi nucleos(t)idici (NUC). A causa della bassa percentuale di clearance di HBsAg e di sieroconversione anti-HBs ottenibile con i farmaci attualmente disponibili, lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative che possano accelerare la perdita di HBsAg e la produzione di anticorpi anti-HBs rappresenta un’esigenza clinica prioritaria. I pazienti con infezione cronica da HBV presentano difetti funzionali delle risposte immunitarie antivirali, che tendono ad approfondirsi con il passare del tempo, contribuendo in tal modo alla persistenza virale. In questa prospettiva, la modulazione delle risposte T linfocitarie HBV-specifiche mediante l’utilizzo di composti ad azione immunomodulante rappresenta una strategia potenzialmente efficace nel tentativo di implementare la risposta immunitaria nei pazienti con infezione cronica da HBV. Sulla base di studi precedenti eseguiti nel modello murino di infezione da LCMV e nell’infezioni croniche da HCV e HIV nell’uomo, è noto come i linfociti T virus-specifici rappresentino una popolazione cellulare eterogenea caratterizzata da distinti subsets T linfocitari coesistenti con vario grado di exhaustion e con differente risposta al blocco di pathway inibitori. Per approfondire il fenomeno dell’esaurimento T linfocitario nei pazienti con infezione cronica da virus B, risulta di fondamentale importanza la comprensione di quanto eterogenee siano le popolazioni cellulari HBV specifiche e se l’analisi dei differenti subsets T linfocitari possa essere utile per predire la risposta a strategie terapeutiche correttive immunomodulanti.A questo proposito, l’analisi simultanea di fattori di trascrizione, recettori coinibitori e molecole di differenziazione, come ad esempio PD1, CD39, TOX, CD127, Bcl-2 e TCF1, ha permesso di distinguere subsets di linfociti T con migliore attività antivirale in differenti categorie di pazienti.L’analisi della co-espressione dei suddetti marcatori ha consentito di definire specifici subsets di linfociti con vario grado di disfunzione, che potrebbero essere variamente suscettibili di strategie correttive della loro funzione. Più precisamente, focalizzando l’attenzione sull’espressione di PD1 e CD127, i dati mostrano come i linfociti CD8 HBV-specifici destramero-positivi si distribuiscano in modo differente nelle diverse casistiche cliniche di pazienti: la sottopopolazione cellulare PD1high CD127low/- sembra essere prevalentemente espressa dai soggetti con infezione cronica non trattati, configurando un profilo fenotipico più “exhausted”; al contrario il subset cellulare PD1low/- CD127high sembra caratterizzare i linfociti CD8 HBV-specifici di pazienti che hanno sviluppato anticorpi anti-HBs come pure quelli CD8 influenza-specifici. Infine la sottopopolazione PD1high CD127high risulta presente in tutti i gruppi di pazienti, indipendentemente dalle condizioni cliniche e dal livello di controllo anti-virale. Lo studio funzionale ha evidenziato un livello percentuale di produzione di citochine antivirali ex vivo globalmente più basso nei pazienti con epatite cronica rispetto ai pazienti che hanno conseguito controllo anti-virale. In particolare, la produzione di citochine anti-virali è risultata essere significativamente meno efficiente all’interno del subset T linfocitario PD1high CD127low/- rispetto a quella rilevata nei subsets PD1low/- CD127high e PD1highCD127high. Al contrario, la produzione citochinica è risultata essere omogeneamente espressa all’interno dello stesso subset PD1low/- CD127high per tutte le categorie di pazienti. L’analisi comparativa dei risultati fenotipici e funzionali ha evidenziato come alcuni pazienti con infezione cronica, caratterizzati da un profilo fenotipico meno “exhausted”, mostrassero un profilo paragonabile ai soggetti che sono andati incontro a guarigione. Infine, per implementare questo algoritmo predittivo sono stati analizzati ex vivo ulteriori marcatori fenotipici di differenziazione e co-inibitori quali CD39, TOX, Bcl-2 e TCF1. In linea con studi precedenti, l’espressione del marcatore di esaurimento CD39 è risultata rilevabile prevalentemente nei pazienti infettati cronicamente, evidenziando una correlazione statisticamente significativa tra i livelli di questo marcatore e la frequenza del subset più “exhausted” PD1high CD127low/-. Analogamente, anche il marcatore di esaurimento TOX è risultato maggiormente espresso nella sottopopolazione più disfunzionale PD1high CD127low/- rispetto a quella più protettiva PD1low/- CD127high. Al contrario, il fattore di trascrizione TCF1, coinvolto nella differenziazione cellulare e nel mantenimento di memoria proteggente, così come la molecola anti-apoptotica Bcl-2 sono risultati significativamente up-regolati nei subsets PD1low/- CD127high e PD1highCD127high rispetto alla sottopopolazione più esaurita PD1high CD127low/-. La frequenza relativa di differenti subsets linfocitari con distinti gradi di exhaustion in singoli pazienti potrebbe permettere di identificare una coorte di pazienti con infezione cronica caratterizzati da un sistema immunitario più efficiente, i quali potrebbero mostrare una migliore possibilità di risposta a strategie terapeutiche immunomodulanti. Tali informazioni potrebbero essere applicate per lo sviluppo di strategie di ripristino immuno-terapeutico per la cura dell’infezione cronica da HBV e per monitorare in modo ottimale i risultati ottenuti con i nuovi composti antivirali.