GCN5 contributes to intracellular lipid accumulation in human primary cardiac fibroblasts in Arrhythmogenic Cardiomyopathy

Abstract

La Cardiomiopatia Aritmogena (ACM) è una malattia genetica dovuta alla presenza di mutazioni in geni desmosomali, con bassa penetranza ed espressività variabile. Dal punto di vista fenotipico è caratterizzata da una progressiva sostituzione fibro-adiposa a livello del miocardio, aritmia ventricolare e morte cardiaca improvvisa. L’aritmia è generalmente trattata con l’inserimento di un defibrillatore sottocutaneo, mentre per la sostituzione fibro-adiposa non sono ancora stati individuati trattamenti farmacologici, fatta eccezione per il trapianto di cuore, suggerito in pazienti con grave insufficienza cardiaca. Per anni, l´ACM è stata considerata come una patologia a carico dei cardiomiociti, ma recentemente alcuni lavori hanno portato alla luce un possibile ruolo delle cellule stromali cardiache (CStCs) nell’accumulo adiposo nel cuore di pazienti affetti da ACM. Per questo motivo, in questo lavoro di dottorato, le CStCs sono state usate come modello cellulare per lo studio dell´ACM. Le CStCs sono cellule di origine mesenchimale, abbondanti nel miocardio e coinvolti in molti processi legati al funzionamento del cuore, come la sintesi e la deposizione di matrice extracellulare, comunicazione intercellulare con i cardiomiociti, produzione di fattori di crescita e citochine. Inoltre, le CStCs sono anche in grado di transdifferenziare in altri tipi cellulari, inclusi gli adipociti. Vari studi hanno dimostrato che l’istone acetiltransferasi GCN5 puo´ avere un ruolo nell’accumulo lipidico, tramite la regolazione genica di PPARγ, principale effettore della cascata adipogenica. Lo scopo di questo lavoro di dottorato è stato quello di valutare se GCN5 puo´ svolgere un ruolo nell’accumulo lipidico in cellule primarie ventricolari, ottenute da pazienti affetti da ACM e da donatori sani (NON ACM). Le CStCs sono state isolate da campioni di biopsie ventricolari di pazienti che si sono sottoposti a interventi chirurgici, per motivi diagnostici, al Centro Cardiologico Monzino (Milano, Italia). Le cellule sono state poi amplificate in terreno basale e caratterizzate al citofluorimetro. Tramite western blot è stata valutata, in terreno basale, l’espressione proteica di GCN5, ed è stata evidenziata una maggiore espressione proteica di questa acetiltransferasi nelle cellule ottenute da pazienti rispetto ai controlli. Inoltre, modulando l’espressione genica di GCN5 tramite l’utilizzo di shRNA e riducendone l´attivita´ tramite inibizione farmacologica con MB-3, è stato osservato un ridotto accumulo lipidico citoplasmatico in cellule stromali cardiache di pazienti affetti da ACM. Abbiamo, quindi, cercato di individuare i meccanismi molecolari coinvolti nell’accumulo lipidico, trattando le cellule con terreno adipogenico e con l’inibitore selettivo, MB-3. Da un’analisi preliminare dei risultati di RNAseq di campioni di ACM esposti a terreno adipogenico in presenza o meno di MB-3, sembra esserci una modulazione di vari processi associati alla riorganizzazione della matrice extracellulare, processi metabolici e processi coinvolti nello stress ossidativo. Tutti questi risultati sono da considerarsi preliminari, e ulteriori esperimenti di validazione saranno necessari. Tuttavia, in linea con i risultati del trascrittoma, il trattamento con MB-3 sembra essere in grado di diminuire la concentrazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) mitocondriali, che abbiamo visto essere maggiore nei pazienti affetti da ACM rispetto ai controlli. Abbiamo anche un’indicazione dell´ aumento della capacità di respirazione in CStCs di pazienti affetti da ACM rispetto ai controlli, dopo 7 giorni in terreno adipogenico. Tutte queste osservazioni portano a presupporre un possibile ruolo nei mitocondri nella patogenesi dell´ACM. Infine, abbiamo anche evidenze dell’espressione ex vivo di GCN5 in campioni di tessuti autoptici: dall’analisi immunoistochimica risulta che il 30% di cellule con morfologia fibroblastoide sono positive per GCN5. Tutti i dati riportati in questo lavoro, indicano che l’inibizione di GCN5 porta a una riduzione dell’accumulo lipidico in CStCs di pazienti con ACM, andando anche a modulare vari processi metabolici. Ulteriori esperimenti saranno necessari per chiarire il ruolo di GCN5 nell’insorgenza della malattia, anche se questi risuliati potrebbero essere utili per l’identificazione di nuovi possibili target farmacologici.

Arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM) is a genetic disorder due to mutations in desmosomal genes, showing low penetrance and variable expressivity. It is phenotypically characterized by progressive myocardial fibro-fatty replacement, ventricular arrhythmias and sudden death. Arrhythmias can be treated by the implantation of a cardioverter device, while for the fibro-fatty degeneration no conventional therapies exist except for heart transplantation in patients with end-stage heart failure. For years, ACM has been considered as a cardiomyocyte disease, though recent evidences underline a role of cardiac stromal cells (CStCs) as a source of adipocytes in ACM hearts. Therefore, in this study CStCs have been used as in vitro model for the investigation of ACM. CStCs are cells of mesenchymal origin particularly abundant in the myocardium, and involved in many aspects of cardiac functions, such as synthesis and deposition of extra cellular matrix (ECM), cell-cell communication, intercellular signaling and production of growth factors and cytokines. They also have a potential to differentiate into several other cell types, including adipocytes. Several studies demonstrate that histone acetyltransferase GCN5 facilitates adipogenesis through the regulation of PPARγ, master gene of adipogenesis. The aim of this work is to evaluate whether GCN5 is involved in intracellular lipid accumulation in human primary ventricular CStCs obtained from ACM patients and healthy donors (NON ACM). Therefore, CStCs have been isolated from ventricular samples obtained from patients undergoing biopsies for diagnostic reasons at the Centro Cardiologico Monzino (Milano, Italy). CStCs are cultured, amplified in basal medium (BM) and characterized by flow cytometry. Western Blot analysis show that, when cultured in BM, ACM CStCs express higher GCN5 protein levels compared to NON ACM CStCs. Interestingly, we observe that GCN5 down-modulation by shRNA silencing significantly reduce intracellular lipid accumulation in ACM CStCs when exposed to an adipogenic milieu (AM). In addition, when CStCs are treated with 200 μmol/L MB-3, a specific inhibitor of GCN5, we also observe a dramatic reduction of lipid accumulation in ACM CStCs. Therefore, we try to investigate the mechanisms involved in the reduction of lipid accumulation after GCN5 inhibition/knockdown. A preliminary RNAseq analysis of ACM CStCs exposed to adipogenic medium and adipogenic medium in presence of MB-3, reveal the modulation of several interesting classes of genes, namely those associated with extracellular matrix re-organization, metabolic processes and redox balance. These evidences should be considered as preliminary and further analysis are required to confirm the data. However, in agreement with the transcriptome preliminary evidence, MB-3 administration is able to restore mitochondrial ROS concentration that results upregulated in ACM CStCs compared to NON ACM. We have also collected preliminary data regarding the respiratory activity of NON ACM CStCs and ACM CStCs after the exposure to adipogenic medium, observing an increased oxidative phosphorylation in ACM CStCs. Taken together, all these observations, sustain a possible role of mitochondria in ACM pathogenesis. Finally, we also have evidences of GCN5 expression in ex-vivo samples: approximately the 30% of spindle fibroblast-like cells present in the region of fatty substitution of three ACM human right ventricles samples show increased positivity for GCN5 evaluated by immunohistochemistry evaluation. The collected results indicate that GCN5 inhibition might reduce fat accumulation of ACM CStCs, possibly by modulating intracellular redox processes. Further experiments are mandatory to elucidate GCN5 function and its downstream players in the onset of the disease. These results might pave the way for the identification of possible new target for pharmacological interventions.