In vitro and in vivo infection of porcine monocyte-macrophages-lineage cells with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) isolates with different pathogenicity

Abstract

Abstract

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) represents one of the most important viruses affecting the swine population with a huge impact on pig production in many countries. Moreover, the recent emergence of some highly pathogenic isolates (HP-PRRSV-1) has caused more severe economic losses. The effects of PRRSV on the immune system is poorly understood, indeed, the infection and persistence of the virus is related to a complex interaction with the immune system that determines a dysregulation on the mechanisms and the secretion of important cytokines of the host. The virus shows a restricted tropism for cells from the monocyte-macrophage-lineage, the main in vivo target cells is represented by porcine alveolar macrophages (PAM). The aim of the present thesis is to analysing the response of the macrophages population to the infection of different PRRSV isolates, both in vitro and in vivo. In the first in vitro study, we used as a model, monocytes derived macrophages (MDMs) pre-treated with different cytokines as IFNγ, IL-4 and IFNβ. Nine PRRSV-1 isolates were analyzed: two Italian strains, five Eastern European strains, and Lena and Lelystad as reference-strains for HP and low pathogenic PRRSV, respectively. The different strains were able to infect MDMs, with the best efficiency in unpolarized MØ and IL-4 treated MDMs, while the IFN-treatment determined an antiviral state, this evidence was most pronounced with IFNβ. In general, the high pathogenicity isolates infected a higher percentage of MDMs and replicated to higher titers. Regarding the cytokines measurement, IFNα and IL-10 were not detected in the supernatant of infected MDMs; moreover, the Italian PR40 strain was the only one that induced a significant release of TNF-α and IL1-β. The second study was performed by using as a model the polarized-porcine alveolar macrophages (PAMs) pre-treated with IFNγ, IL-4 and IFNβ, in order to compare two PRRSV-1.1 Italian strains, the normal pathogenic PR11 strain and the HP-PRRSV PR40. Interesting, we did not see difference between the two isolates, and any difference in the infectivity among Mock, IL-4 and IFNγ treatments, that evidence could found explanation in a re-polarization from the M1 to M2 phenotype after the infection. While, the infection of both viruses was completely blocked by IFNβ-treatment, highlighting the antiviral state induced by Interferon. Moreover, both strains did not induce the production of the cytokines tested: IFNα, IL-10 and TNF- α. The in vivo study consisted in two different experiments, the aim of the first one was to analyse the impact of two Italian PRRSV-1 subtype 1 strains (PR11 and PR40), with different in vivo pathogenicity, on the macrophages population of the thymus, as target cell for both PRRSV replication and response of the host immune system. The second experiment aimed at evaluating the effect of a heterologous vaccination on macrophages population of the thymus after a challenge infection with a HP-PRRSV. In order to define the macrophages population, immunohistochemistry for the N protein of the virus, TUNEL labelling and immunolabeling for CD163, CD172a, CD107a and BA4D5 was performed. The thymus of the animals infected with PRRSV strains, PR11 and PR40 dead at 10-14 dpi showed more severe lesions and the higher number of macrophages in all the compartments of the thymus gland compared with the others groups. This last result suggests a strong and early inflammatory process, without any difference between the normal and highly pathogenic strain.

Riassunto

Il virus della sindrome respiratoria e riproduttiva suina (PRRSV) è considerato uno dei più importanti virus del suino, con un grave impatto economico sulla produzione suinicola mondiale. Recentemente, sono emersi nuovi isolati del virus, caratterizzati da maggiore patogenicità e mortalità, e quindi definiti ceppi ad alta patogenicità (HP-PRRSV). Gli effetti dell’infezione da PRRSV sul sistema immunitario del suino sono ancora poco conosciuti, in quanto l’infezione e la persistenza del virus sono associate ad una complessa interazione con l’ospite, che determina una dis-regolazione dei meccanismi immunitari. Il virus presenta un tropismo selettivo per le cellule della linea monocitaria, e il principale target in vivo è rappresentato dai macrofagi alveolari. Lo scopo di questa tesi è stato quello di analizzare come viene influenzata la popolazione macrofagica in seguito all’ infezione con differenti isolati di PRRSV, sia in vitro che in vivo. Nel primo studio in vitro, il modello cellulare utilizzato è rappresentato dai “macrofagi derivanti da monociti” (monocytes derived macrophages (MDMs)), stimolati con diverse citochine quali IFNγ, IL-4 and IFNβ. Sono stati utilizzati nove diversi isolati: due Italiani, due dell’Est Europa, mentre i ceppi Lena e Lelystad sono stati utilizzati come isolati di riferimento per i ceppi ad alta e bassa patogenicità, rispettivamente. Tutti i virus utilizzati sono stati in grado di infettare il modello; una maggiore efficienza è stata riscontrata in MDMs non trattati e in quelli trattati con IL-4. Il trattamento con IFN ha determinato invece uno stato antivirale, particolarmente evidente con IFNβ. In generale, i ceppi ad alta patogenicità hanno presentato una maggiore capacità infettiva e hanno replicato a un titolo maggiore. Riguardo la produzione di citochine, IFNα and IL-10 non sono state rilevate nel surnatante delle cellule infette, mentre, HP-PRRSV PR40 è stato l’unico isolato ad indurre un significativo rilascio di TNF-α and IL1-β. Il secondo studio in vitro, è stato invece condotto utilizzando come modello cellulare i macrofagi alveolari trattati con IFNγ, IL-4 o IFNβ, per valutare la risposta all’infezione con due ceppi Italiani, un ceppo a normale patogenicità PR11 e un ceppo ad alta patogenicità PR40. Inaspettatamente, non è stata rilevata alcuna differenza tra i due isolati, indipendentemente dal trattamento dei macrofagi. Questo risultato potrebbe trovare spiegazione in una ri-polarizzazione dei macrofagi dal fenotipo M1 al fenotipo M2 determinato dall’infezione. al contrario, l’infezione di entrambi gli isolati è stata completamente bloccata dal pre-trattamento con IFNβ, sottolineando lo stato antivirale indotto dall’intereferone. Inoltre, entrambi gli isolati non hanno indotto la produzione di IFNα, IL-10 and TNF-α. Lo studio in vivo si è articolato in due diversi esperimenti, il primo ha avuto lo scopo di analizzare l’effetto indotto dall’infezione con due isolati italiani (PR11 e PR40) a diversa patogenicità, sulla popolazione macrofagica del timo, target per la replicazione del virus e per valutare la risposta immunitaria. Il secondo esperimento ha invece valutato l’efficacia di un vaccino commerciale in seguito al challenge con un ceppo ad alta patogenicita (HP-PRRSV PR40). Per valutare la risposta macrofagica all’infezione, è stata condotta un’analisi in immunoistochimica valutando la presenza del virus, TUNEL per valutare la morta cellulare e, la modulazione di diversi marker specifici per i macrofagi: CD163, CD172a, CD107a e BA4D5. Il timo degli animali infetti con entrambi i virus, PR11 e PR40 morti prima della conclusione dell’esperimento, tra i dieci e i quattordici giorni post-infezione (10-14 dpi), mostrava gravi lesioni, una maggiore presenza del virus a livello cellulare, morte cellulare ed un aumento del numero di macrofagi in tutti i compartimenti. Questi risultati suggeriscono un forte e precoce processo infiammatorio, senza alcuna particolare differenza tra gli isolati utilizzati.