Study of the immune-microenvironment in Multiple Myeloma: understanding the effects of immunomodulatory drugs and the contribution of immune checkpoints in disease progression

Abstract

Despite major improvements in the treatment landscape, multiple myeloma (MM) remains an incurable malignancy. Alterations of the bone marrow (BM) immune-microenvironment, due to the presence of malignant plasma cells, characterize the progression of monoclonal gammopathies and the development of osteolytic bone disease. “Immunoparesis” is a common feature of MM patients displaying impaired dendritic, natural killer and T cell functions, whereas the onset of MM osteolytic lesions is associated to an increased prevalence of Th17 cells. Most recently, preclinical studies have also suggested the role of PD-1/PD-L1 pathway in the induction of tumor tolerance and immune evasion. However, contradictory results are currently available on the expression profile of PD-1/PD-L1 axis in MM patients and the possible correlation with the presence of osteolytic bone disease has not yet been explored. Among the therapeutic strategies, the development of the Immunomodulatory drugs represented a paradigm shift in the treatment of MM. Lenalidomide-based regimen is one of the standard of care for MM patients either in frontline or in relapsed setting. However, the use of lenalidomide, alone or in combination with immune checkpoint blockade, to reverse tumor-mediated immune suppression and amplify MM-specific immunity is currently under investigation. Particularly lenalidomide effects on dendritic cells are still unclear. In this study, the potential effect of lenalidomide on dendritic cell differentiation and activity has been investigated. Dendritic cells were differentiated from either primary MM CD14+ cells or from a human monocytic cell line. Lenalidomide, at the concentration range reached in vivo, significantly increased the median intensity expression of HLA-DR, CD86 and CD209 by dendritic cells derived from both BM and peripheral myeloma monocytes and enhanced the production of Interleukin-8, C-C motif chemokine ligand 2 and tumor necrosis factor-α. Consistently, lenalidomide pre-treated dendritic cells showed an increased ability to stimulate autologous CD3+ cell proliferation. Lenalidomide effect on dendritic differentiation was associated with the degradation of the Cereblon-related factors Ikaros and Aiolos in monocytes. Moreover, lenalidomide in vitro treatment blunted mesenchymal stromal cell inhibitory effect on dendritic differentiation inhibiting casein kinase-1α levels. Finally, in vitro data were confirmed in ex-vivo cultures obtained from relapsed myeloma patients treated with lenalidomide at 25 mg/day showing a significant increase of dendritic cell differentiation from peripheral blood monocytes. In conclusion, lenalidomide increased the expression of mature dendritic markers both directly and indirectly and enhanced dendritic cell ability to stimulate T cell proliferation and to release chemokines. This suggests a new possible mechanism by which lenalidomide could exert its anti-myeloma activity. In the second part of the study, the expression profile of PD-1/PD-L1 was evaluated in plasma cells, monocytes and T cells from BM aspirates of patients with monoclonal gammopathies and the results were correlated with clinical data, especially the presence of bone disease. Interestingly, an increased frequency of PD-1+ T cells was observed across the progression of the disease. Moreover, for the first time, it was found a significant relationship between the presence of extensive osteolytic bone disease and a reduced expression of PD-1 on BM CD8+ T cells and PD-L1 on malignant PCs and monocytes in MM patients. It was thus hypothesized that a less immune-suppressive profile could be related to the development of osteolysis and probably mediated by the effect of PD-1/PD-L1 axis on Treg/Th17 cell ratio. These preliminary data thus provide a new mechanism by which PD-1/PD-L1 axis could exert its effect within MM BM microenvironment.

Il Mieloma Multiplo (MM) è una neoplasia ematologica caratterizzata dalla proliferazione clonale di plasmacellule (PC) maligne a livello del midollo osseo. La presenza delle PC causa soppressione della risposta immunitaria e induce l’insorgenza di malattia ossea. I pazienti con MM mostrano infatti deficit numerici e funzionali a carico di linfociti T, cellule natural killer e cellule dendritiche (DC). L’accumulo di linfociti Th17 correla invece con lo sviluppo di lesioni litiche. Recentemente è inoltre emerso il ruolo dell’asse PD-1/PD-L1 nella soppressione immunitaria e nella progressione di malattia sia in tumori solidi che ematologici, tuttavia non è ad oggi chiara la funzione di tale checkpoint nel MM. Tra gli agenti terapeutici attualmente in uso per la cura del MM, i farmaci immunomodulatori (IMiD®) come la lenalidomide (LEN) rappresentano uno “standard of care”. Tuttavia l’attività di potenziamento della risposta immunitaria contro il MM da parte degli IMiD® non è ancora del tutto chiara. Nella prima parte di questo studio è stato quindi valutato l’effetto diretto della LEN sul differenziamento delle DC e sulle proprietà immunosoppressive delle cellule mesenchimali stromali (MSC). Le DC sono state ottenute in vitro da monociti CD14+, purificati sia da sangue periferico che da midollo osseo di pazienti con MM. Durante il periodo di differenziamento, le cellule sono state trattate con LEN a diverse concentrazioni (0.1-1μM), equivalenti ai livelli sierici riscontrati in pazienti trattati con LEN (5-25mg/die). Al termine della coltura le cellule sono state analizzate tramite citofluorimetria per i markers di maturazione (CD83, HLA-DR, CD80, CD86 e CD209). I livelli di fattori solubili coinvolti nella risposta immunitaria (CCL2, CCL5, CXCL10, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNF-α) sono inoltre stati dosati tramite ELISA nei surnatanti di tali colture. Dai risultati è emerso che il trattamento con LEN causa una riduzione del numero e della percentuale delle DC mature rispetto ai controlli non trattati e un aumento significativo dell’espressione di CD86, HLA-DR e CD209 sia nelle DC derivate da midollo che da sangue periferico. Tale effetto è mediato dalla degradazione, Cereblon-dipendente, dei due fattori di trascrizione Ikaros e Aiolos. Inoltre, il trattamento con LEN aumenta la produzione da parte delle DC di IL-8, CCL2 e TNF-α e potenzia la capacità delle DC di stimolare la proliferazione di cellule T autologhe. È interessante notare come anche il trattamento in vivo con LEN (25mg/die) in pazienti affetti da MM induca un aumento dell’espressione dei marker di maturazione delle DC, differenziate a partire da cellule CD14+ purificate da sangue periferico al giorno 0 e al giorno 7 di trattamento con LEN. Accanto all’effetto diretto della LEN sulle DC, da questo studio è emerso che il trattamento con LEN riduce l’effetto inibitorio delle MSC sul differenziamento delle DC, tramite down-regolazione di CK1-α nelle MSC. In conclusione, questi dati suggeriscono nuovi possibili meccanismi con cui gli IMiD® potenziano la risposta immunitaria anti-mieloma. Nella seconda parte dello studio, il profilo di espressione di PD-1/PD-L1 è stato valutato su PC, monociti e cellule T ottenute da aspirato midollare di pazienti con gammopatia monoclonale a diverso stadio di malattia; i risultati sono stati poi correlati con i dati clinici, in particolare con la presenza di malattia ossea. Una maggiore frequenza di cellule T PD-1+ è stata osservata nel corso della progressione della malattia. Inoltre, per la prima volta, è stata trovata una relazione significativa tra la presenza di malattia ossea osteolitica e una ridotta espressione di PD-1 su cellule CD8+ e di PD-L1 su PC maligne e monociti in pazienti con MM. L’ipotesi è che un profilo meno immunosoppressivo possa essere correlato allo sviluppo dell'osteolisi e probabilmente mediato dal ruolo di PD-1/PD-L1 nel bilanciamento del rapporto cellule Treg/Th17. Questi dati preliminari forniscono quindi un nuovo meccanismo attraverso il quale l’asse PD-1/PD-L1 potrebbe esercitare il suo effetto all'interno del microambiente midollare nel MM.