Evolutionary study over space and time of lactic acid bacteria used as starter in cheeses manufacturing

Abstract

Microorganisms have been mutating and evolving on Earth for billions of years. Undoubtedly, microorganisms in general and bacteria in particular are extremely successful in inhabiting and adapting to diverse ecological niches available in the biosphere. That’s because bacteria are characterized by a short generation times and large population sizes, but also thanks to transposons, plasmids and bacteriophages, that play a key role, moving and rearranging the presence and the order of genes in the chromosome. Food matrices can be viewed as different ecosystems, characterized by diverse stressful and selective conditions, leading to bacteria to adapt rapidly, acquiring or maintaining genes useful for their survival or losing genes no more helpful for the cell in those conditions. Lactic acid bacteria (LAB) are the most important bacteria traditionally associated with food fermentation due to their long and safe history of application. LAB have a spread ecological distribution; they are to be found in different environments, from milk and dairy products, vegetable and plants until cereals and meat. Besides, their presence in different ecological niches, LAB are commonly associated to dairy environment, in particular to starter cultures, which ‘start’ the fermentative process, producing lactic acid; their primary purpose in cheese manufacture. Many studies have demonstrated that these starter cultures have a large variability at strain level, rather than at species level. Even if, LAB biodiversity was extensively assessed in different works, a depth exploration of technological traits, lost or acquired, over the years, and in different ecological niches, have been very poorly investigated. Based on these assumptions, the aim of this PhD thesis is to investigate how selective pressures, due to environmental or technological drivers, shape the bacterial genome of LAB and microbial communities over the time and/or through different ecological niches (space). The main object of this doctoral project was to lay the foundations for understanding the factors that contribute to the selection, in order to direct the technology to favour a biotype rather than another in a specific environment. This PhD thesis was organized in four main sections. The first section was devoted to study a new protocol to perform in a quickly, cheaply and simply way, Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) analysis. The second section was focused on Streptococcus thermophilus strains isolated from Pecorino Toscano ecosystem over time. It has been investigated if the strains isolated in different years from this niche, were able to produce histamine and tyramine, in order to understand if there has been an evolution over time of genetic traits involved in biogenic amines production. The third section has concerned the genome study of Lactobacillus helveticus strains isolated from fully different ecosystems, to gain an insight into the role of selective pressures in the genome evolution and to identify highly desirable traits with technological potential. Throughout the last section the microbial community of natural starter culture, used in Parmigiano Reggiano manufacturing, was investigated to understand how selective and environmental forces (like the seasonality and different temperatures in the technological process) shape the structure of this bacterial consortium. The results obtained highlighted the importance to study how technological and environmental pressures, over time and space, change the ecosystem scenario, leading bacteria to acquire, maintain or lose genetic traits. Overall, the biodiversity, found in different ecological niches, should be perceived as a great richness; the leak of these biotypes could mean losing technological traits that may reoccur useful for various applications.

Per miliardi di anni i microrganismi si sono trasformati ed evoluti sulla Terra. Indubbiamente, i microrganismi in generale e i batteri in particolare hanno un enorme successo nel risiedere e adattarsi nelle diverse nicchie ecologiche disponibili nella biosfera. Questo perché i batteri sono caratterizzati da tempi di generazione brevi e grandi dimensioni della popolazione, ma anche grazie a trasposoni, plasmidi e batteriofagi, che giocano un ruolo chiave, spostando e riorganizzando la presenza e l'ordine dei geni nel cromosoma. Le matrici alimentari possono essere considerate come diversi ecosistemi, caratterizzate da diverse condizioni stressanti e selettive, che portano i batteri a adattarsi rapidamente, acquisendo o mantenendo i geni utili per la loro sopravvivenza o perdendo geni non più utili per la cellula in quelle condizioni. I batteri lattici sono batteri tradizionalmente associati alla fermentazione degli alimenti a causa della loro lunga e sicura storia di applicazione. I batteri lattici hanno una distribuzione ecologica diffusa; possono risiedere in diversi ambienti, dal latte a prodotti lattiero-caseari, dai vegetali alle piante, fino a cereali e carne. I batteri lattici sono comunemente associati all'ambiente lattiero-caseario, in particolare alle colture starter, che "avviano" il processo fermentativo, producendo acido lattico; il loro scopo principale nella produzione di formaggio. Molti studi hanno dimostrato che queste colture starter hanno una grande variabilità a livello di ceppo, piuttosto che a livello di specie. Anche se la biodiversità dei batteri lattici, è stata ampiamente studiata in diversi lavori, una profonda esplorazione dei tratti tecnologici, persi o acquisiti, nel corso degli anni, e in diverse nicchie ecologiche è stata studiata molto poco. Sulla base di questi presupposti, lo scopo di questa tesi di dottorato è quello di indagare come le pressioni selettive, dovute a fattori ambientali o tecnologici, modellano il genoma batterico dei batteri lattici e delle comunità microbiche nel tempo e/o attraverso diversi ecosistemi (spazio). Il principale obbiettivo di questo progetto di dottorato era porre le fondamenta per comprendere i fattori che contribuiscono alla selezione, al fine di indirizzare la tecnologia nel favorire un biotipo piuttosto che un altro in un ambiente specifico. Questa tesi di dottorato è stata organizzata in quattro sezioni principali. La prima sezione è stata dedicata allo studio di un nuovo protocollo per eseguire in modo rapido, economico e semplice, l'analisi genomica Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP). La seconda sezione si è focalizzata sui ceppi di Streptococcus thermophilus isolati nel tempo dall'ecosistema del Pecorino Toscano. È stato studiato se i ceppi isolati in anni diversi da questa nicchia, fossero in grado di produrre istamina e tiramina al fine di comprendere se nel tempo vi sia stata un'evoluzione dei tratti genetici coinvolti nella produzione di ammine biogene. La terza sezione ha riguardato lo studio del genoma di diversi ceppi di Lactobacillus helveticus isolati da ecosistemi completamente diversi, per avere una panoramica sul ruolo delle pressioni selettive nell'evoluzione del genoma e identificare tratti genetici altamente interessanti dal punto di vista tecnologico. Nell'ultima sezione la comunità microbica di colture starter, utilizzate nella produzione del Parmigiano Reggiano, è stata studiata al fine di comprendere come forze selettive e ambientali (come la stagionalità, le diverse temperature nel processo tecnologico) modellano la struttura di questo consorzio batterico. I risultati ottenuti hanno evidenziato l’importanza di studiare come le pressioni tecnologiche e ambientali, nel tempo e nello spazio, cambiano lo scenario dell’ecosistema, portando i batteri a modificare il proprio genoma, acquisendo, mantenendo o perdendo tratti genetici. Complessivamente, la biodiversità, che si trova in diverse nicchie ecologiche, dovrebbe essere percepita come una grande ricchezza; la perdita di questi biotipi potrebbe significare perdere tratti tecnologici che potrebbero ripresentarsi utili per varie applicazioni future.