Riduzione del danno al miocardio da ischemia-riperfusione inibendo l'Interleukina-1 alpha

Abstract

RIASSUNTO: La risposta infiammatoria è una componente essenziale nel processo di guarigione ma se sovrabbondante e non controllata, può rivelarsi deleteria. Durante un infarto acuto del miocardio, un’improvvisa ostruzione del flusso coronarico comporta un danno ischemico con conseguente morte dei cardiomiociti. L’attivazione della risposta immunitaria innata, induce il rilascio di citochine e chemochine che, coordinando il reclutamento delle cellule infiammatorie, porta alla risoluzione del processo infiammatorio. Quando le cellule subiscono un danno necrotico, la pro-Interleukina-1α (pro-IL-1α) viene immediatamente rilasciata come segnale di “allarme” e attivando le cellule contigue, dà inizio al processo infiammatorio. Differentemente dall’IL-1β, la pro-IL-1α è da subito attiva nella sua proforma. Il rilascio di pro-IL-1α è così da considerarsi uno degli eventi iniziatori che guidano la risposta infiammatoria nel sito di danno. La successiva formazione dell’inflammosoma nei leucociti e nelle cellule residenti è così da considerarsi l’evento chiave che porta all’amplificazione dell’intero processo. A tal fine, abbiamo ipotizzato che il rilascio di IL-1α in seguito alla morte dei cardiomiociti per ischemia porti ad una attivazione del inflammosoma esacerbando l’estensione dell’infarto durante la fase di riperfusione dell’organo. In questo studio, abbiamo investigato l’abilità di IL-1α di indurre morte cellulare mediata dall’inflammosoma. IL-1α esogena, in combinazione con ATP (5mM) è stata aggiunta al medium di coltura di cellule HL-1 (linea tumorale di cardiomiociti atriali di topo), NIH 3T3 (fibroblasti murini) e J774A.1 (macrofagi murini) per testare l’abilità di indurre l’attivazione dell’inflammosoma. L’aggiunta di IL-1α esogena (100 ng/ml) al medium di coltura delle cellule HL-1 ha indotto mortalità cellulare 6 volte maggiore rispetto ai controlli (P<0.05). Questo effetto non è risultato apprezzabile né nei macrofagi né nei fibroblasti coltivati. In condizioni di ipossia simulata, della durata di 6 ore, l’aggiunta di un anticorpo bloccante gli effetti dell’IL-1α (50ng/ml) al medium di coltura di cellule HL-1 ha significativamente diminuito la morte cellulare del 50% (P<0.001). Questo effetto supporta l’ipotesi che IL-1α agisca da iniziatrice del segnale di attivazione dell’inflammosoma NLRP3. Basandoci su questi risultati, abbiamo deciso di testare l’utilizzo dell’anticorpo anti- IL-1α in un modello in-vivo di ischemia e riperfusione nel topo. Abbiamo somministrato l’anticorpo anti IL-1α al momento della riperfusione in via intraperitoneale alla dose di 15ս/kg, in un volume di 100սl. Il danno da ischemia e riperfusione comporta un’attivazione dell’inflammosoma che è stata ridotta del 50% mediante somministrazione dell’anticorpo (P=0.03 comparato al veicolo).In aggiunta, il bloccaggio dell’attività dell’IL-1α ha ridotto l’area infartuale (-52% dell’infarto, espresso come % dell’area a rischio, e riduzione del 79% del rilascio di troponina I cardiaca, P=0.001 comparato al veicolo) preservando la frazione di accorciamento del ventricolo sinistro (31 ± 3 % vs. 25 ± 2% P<0.001 comparato al veicolo).Queste evidenze mostrano come l’inibizione dell’attività dell’IL-1α dopo danno da ischemia e riperfusione nel topo, riduca l’estensione dell’infarto migliorando la funzione contrattile del ventricolo sinistro. L’inibizione dell’IL-1α potrebbe quindi, in futuro, rappresentare una nuova strategia terapeutica per la riduzione del danno da ischemia e riperfusione.

ABSTRACT:The inflammatory response is an essential component of healing after injury, yet an uncontrolled response is deleterious. During acute myocardial infarction, an abrupt obstruction of the flow in the coronary artery leads to ischemic injury and cardiomyocyte death. Activation of the innate immune response by “alarmins” leads to synthesis and release of cytokines and chemokines, coordinating the recruitment of inflammatory cells and ultimately the resolution of the inflammatory response. When cells undergo necrotic cell death, pro-interleukin-1α (pro-IL-1α) is immediately released and initiates a proinflammatory “alarm signal” by activating the nearby cells. Unlike pro-IL-1β, pro-IL-1α is active in its pro-form. The release of pro-IL-1α is therefore considered one of the initiating events driving the local inflammatory response at the site of injury. The formation of the inflammasome within leukocytes and resident cells is a key amplifying event in this process. We therefore hypothesized that the release of IL-1α by cells dying during myocardial ischemia leads to the activation of the inflammasome and further increase of the infarct size during the reperfusion phase. In this study, we first investigated in vitro the ability of exogenous IL-1α to promote inflammasome mediated cell death in cardiomyocytes, fibroblasts and macrophages, cells that reside in the heart. Exogenous IL-1α (100 ng/ml), was used in HL-1 (mouse atrial cardiomyocyte tumor lineage), NIH 3T3 (murine fibroblasts) and J774A.1 (murine macrophages) cell lines to measure its effects as inflammasome primer in combination with ATP (5mM) stimulation. The addition of IL-1α (100 ng/ml) to the medium of HL-1 cells induced a 6-fold increase in cell death compared to the control (P<0.05), while in fibroblast and macrophages IL-1α did not induce a significant cellular mortality. During 6 hours of simulated hypoxia, an IL-1α blocking antibody (IL-1α-AB, 50ng/ml) was added to the medium of HL-1 cells. IL-1α-AB significantly reduced cell death by half, supporting the concept that IL-1α serves as alarmin and a priming signal for the NLRP3 inflammasome formation (P<0.001 vs Control). Based on these results, we decided to test whether blockade of IL-1α could reduce the infarct size and block the inflammasome in an in-vivo model of ischemia reperfusion injury in mice. The IL-1α-AB was administered intraperitoneally immediately after reperfusion at a dose of 15 g/kg, in a volume of 100 l. Ischemia and reperfusion injury led to inflammasome activation while IL-1α blockade significantly reduced inflammasome formation, reflected by a 50% reduction in caspase-1 activity, used as a readout of inflammasome formation (P=0.03 versus vehicle). Moreover, IL-1α blockade reduced the infarct size (-52% infarct expressed as a percentage of area at risk, and -79% for cardiac troponin I serum levels, P=0.001 vs. vehicle) preserving the left ventricular fractional shortening (31 ± 3% vs. 25 ± 2%, P< 0.001 vs. vehicle). Therefore, this evidence shows that IL-1α blockade, after ischemia and reperfusion injury in mice, reduces the inflammasome activation, decreases the extent of the infarcted area, and preserves the left ventricular systolic function. IL-1α blockade may, therefore, represent a novel therapeutic strategy to reduce ischemia and reperfusion injury.