The CXCR4/SDF-1 α axis: target for the migration enhancement of canine adipose-derived mesenchymal stem cells

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono delle cellule staminali adulte capaci di auto-rinnovarsi, di differenziarsi in altri tipi cellulari, di produrre fattori bioattivi e di migrare verso il sito della lesione. Nella medicina veterinaria, le cellule staminali mesenchimali sono considerate come un agente terapeutico promettente. Lo scopo della presente tesi di dottorato, è stato quello di studiare le caratteristiche biologiche delle MSC derivate da tessuto adiposo di cane, per contribuire da un punto di vista biologico a una adeguata caratterizzazione e ottimizzazione dei protocolli di coltura cellulare, con il fine di ottenere una maggiore efficacia terapeutica nella clinica veterinaria. Nella prima parte del lavoro di tesi, è stato caratterizzato l’immunofenotipo delle MSC di cane isolate da tessuto adiposo periviscerale e sottocutaneo, utilizzando un panel di anticorpi specie-specifici. Nella parte successiva del lavoro, sono state valutate, in vitro, le basi molecolari della migrazione di MSC di cane, simulando l’ambiente in vivo. Infine, è stato proposto un modello di coltivazione in vitro di queste cellule per aumentarne la proliferazione cellulare, e l’espressione dei geni e delle proteine coinvolte nella migrazione delle cellule, con lo scopo finale di aumentare la loro efficacia terapeutica. Le cellule derivanti dal tessuto adiposo periviscerale e sottocutaneo sono risultate simili in base al loro profilo immunofenotipico. Il panel di anticorpi utilizzato nella analisi ha permesso di ottenere un quadro di caratterizzazione che rispecchia quanto atteso in base alla letteratura scientifica, per la prima volta basato esclusivamente su anticorpi specifici per antigeni del cane. L’asse CXCR4/SDF-1 α è responsabile della migrazione delle MSC. I passaggi in vitro, come osservato in altre specie, hanno ridotto l’espressione genica e proteica di CXCR4, fatto che potrebbe influenzare negativamente la migrazione delle cellule verso il sito della lesione. L’effetto sinergico del pre-condizionamento delle cellule ottenuto mediante coltura in ambiente ipossico ed in presenza di bFGF ha aumentato sia l’espressione del gene CXCR4 che l’espressione citoplasmatica della proteina CXCR4. Inoltre, il pre-condizionamento ipossico ha aumentato l’espressione del gene SDF-1. Entrambi questi dati indicano una attivazione dell’asse CXCR4/SDF-1 α in queste condizioni, anche se, in ogni caso, la localizzazione sulla superficie cellulare della proteina CXCR4 è rimasta negativa. La presente tesi riporta quindi per la prima volta la caratterizzazione di MSC di cane da tessuto adiposo, con un set di anticorpi specie-specifici che può essere prontamente usato in studi pre-clinici e nella clinica. L’espressione del recettore CXCR4 e del suo ligando SDF-1α è stata studiata per la prima volta in cellule staminali mesenchimali di cane, durante passaggi consecutivi in vitro (P0 – P3) confermando il ruolo di questa via di segnalazione tra cellule come responsabile della migrazione di MSC del cane. Infine, per la prima volta è stato studiato l’effetto sinergico dell’ipossia e del bFGF su MSC, ottenendo risultati promettenti al fine dell’ottimizzazione delle colture di MSC, non solo nel cane, ma anche in altre specie, compreso l’uomo, al fine di ottenere una loro migliore efficacia terapeutica.

Mesenchymal stem cells are multipotent adult stem cells, capable of self-renewal, differentiation into other cell types, production of bioactive factors and migration and homing to inflammation and injury sites. In veterinary medicine, MSCs are currently considered a promising therapeutic tool and have been used for the treatment of different clinical conditions. The goal of the present PhD thesis was to study the biological and clinically relevant features of canine MSCs, and to optimize cell culturing protocols for improved therapeutic effects. In the first part, we characterized canine adipose derived mesenchymal stem cells from perivisceral and subcutaneous adipose tissue, based on their immunophenotype with species-specific canine antibodies. In the subsequent study, we evaluated the molecular mechanisms of MSCs migration towards different chemiotactic gradients, simulating the in vivo environment. Finally, we proposed an in vitro modulation system aimed to increase cell proliferation, and gene and protein expression of molecules involved in MSCs migration and the homing to the target site, with the final aim of increasing their therapeutic efficacy. Canine adipose-derived mesenchymal stem cells deriving from perivisceral and subcutaneous adipose tissue showed a similar immunophenotypic profile. The CXCR4/SDF-1α axis was responsible for cell migration. However in vitro passages reduced the expression of CXCR4 receptor, which can hamper the ability of the cells to migrate to the lesion site. The synergistic effect of hypoxic pre-conditioning and bFGF increased the gene expression of CXCR4, and cytoplasmic expression of the protein CXCR4. Additionally, hypoxic pre-conditioning increased the SDF-1 gene expression. However the surface protein expression remained negative, indicating that additional stimuli are needed for the increase of CXCR4 on the cells.

The present study reports for the first time the characterization of canine adipose-derived mesenchymal stem cells with a panel of species-specific antibodies that can be easily applied for accurate cell characterization in pre-clinical studies and in the clinical setting. The expression of CXCR4 receptor and its ligand SDF-1 in canine adipose-derived mesenchymal stem cells were studied for the first time in consecutive passages (P0-P3) and were found to be responsible for cell migration. Finally, for the first time the synergistic effect of hypoxia and bFGF on mesenchymal stem cells was studied and the promising results indicate that it can be used for cell preconditioning.