Fenotipo e funzionalità delle cellule iNKT nelle varie forme di sclerosi multipla ed in corso di terapie immunomodulanti

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica, demielinizzante e neurodegenerativa del sistema nervoso centrale (SNC), la cui eziologia resta ad oggi sconosciuta, anche se è ben stabilito che una alterazione della risposta immunitaria giochi un ruolo critico nella neuropatogenesi della malattia. Sebbene la risposta immunitaria adattiva mediata dai linfociti T e B sia stata molto studiata nelle diverse forme di malattia, non sono stati ancora individuati dei marcatori immunologici in grado di aiutare a predirne il decorso. Oltre all'immunità adattativa anche l'immunità innata sembra essere sempre più implicata nella patogenesi della SM. Recenti studi scientifici sostengono il coinvolgimento attivo di cellule funzionalmente a ponte tra l’immunità adattiva e quella innata, tra cui le cellule T natural killer invarianti o iNKT, nel regolare le risposte autoimmuni. Nei pazienti con SM è stata descritta un’alterazione del numero e dell'attività di queste cellule, tuttavia gli studi condotti fino ad oggi restano esigui e spesso con risultati contrastanti. Lo scopo dello studio è stato di chiarire se le modificazioni fenotipiche delle cellule iNKT possano essere correlate alle differenze cliniche osservate nei pazienti con diverse forme di SM, alla diversa risposta alle terapie immunomodulanti e all’andamento della malattia. In particolare, mediante il metodo rigoroso basato sulla citometria a flusso policromatica abbiamo valutato la presenza di eventuali differenze nel fenotipo delle cellule iNKT e delle principali sottopopolazioni (CD4+, CD8+, CD161++) in pazienti con diverse forme di SM, in pazienti con SM recidivante-remittente (RR) non trattati con DMT ed in pazienti con SM-RR in trattamento da almeno sei mesi con tali farmaci. I dati immunologici sono stati quindi correlati con i più importanti parametri clinici. Inoltre è stata valutata la produzione di citochine da parte delle iNKT circolanti dopo stimolazione (polifunzionalità). Infine abbiamo valutato se i trattamenti immunomodulanti siano in grado di modificare la frequenza e il fenotipo delle cellule iNKT nei pazienti affetti da SM, confrontando i dati ottenuti dai parametri immunologici prima di iniziare il trattamento con quelli ottenuti dopo 6 e 12 mesi di terapia.

Sono stati arruolati in totale 165 pazienti con varie forme di SM e 55 controlli sani. Da un prelievo di sangue venoso sono state identificate le iNKT mediante la citometria a flusso e analizzate nel fenotipo. Inoltre, in un campione rappresentativo di 55 pazienti è stata analizzata la capacità di produzione simultanea di diverse citochine (IL-17, TNF-α, IFN-γ, and IL-4) dopo stimolazione in vitro. La frequenza delle iNKT è risultata simile nei pazienti con diverse forme e trattamenti di SM; tra le caratteristiche funzionali è emersa una deviazione T helper (Th)1/Th17, più marcata nei pazienti con forma secondaria progressiva (SP) di malattia. Tra i DMT, è emerso che il natalizumab modula una riduzione delle iNKT che producono citochine Th1 e Th17, inibendo la loro azione pro-infiammatoria. In questo studio abbiamo dimostrato che non vi è una differenza nel fenotipo delle cellule iNKT totali di pazienti affetti da varie forme di SM ed in corso dei vari trattamenti immunomodulanti; mentre lo studio della polifunzionalità ha permesso di evidenziare che nei pazienti con forma SP le iNKT esprimono un aumento di produzione citochinica del tipo Th1. Questo suggerisce che queste forme di malattia sono caratterizzate da un’attivazione continua delle iNKT e da un’inclinazione verso un fenotipo pro-infiammatorio costante. Inoltre, nei pazienti con decorso RR e sottoposti a terapia con natalizumab, le iNKT producono meno citochine Th1 e Th17 rispetto che nei pazienti trattati con gli altri DMT, e questo dato potrebbe suggerire un ulteriore meccaniscmo di azione per questo farmaco molto efficace nella SM.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic progressive inflammatory demyelinating and neurodegenerative disorder of the central nervous system (CNS), and is presumed to be an autoimmune disease. However, how this process is generated and controlled by components of the immune system is unclear. The immune cells participating in MS pathogenesis comprise B cells, CD4+, CD8+ and regulatory T cells, as well as innate immunity cells. Although adaptive immunity is clearly involved in multiple sclerosis pathogenesis, innate immunity increasingly appears to be implicated in the disease. These include invariant natural killer T (iNKT) cells, a small population of lymphocytes that express a semi-invariant V24-J18 T cell receptor (TCR) and natural killer cell markers, and are a specialized subset of  T cells that use their T cell receptors to recognize self and foreign lipids presented by CD1d as cognate antigen. iNKT cells have been shown to mediate both protective and regulatory immune functions through a rapid production of cytokines. Several studies have reported numerical and functional iNKT cell defects in MS, and it is yet not clear whether they exert a protective or a pro-inflammatory and harmful role; moreover, a detailed characterization of iNKT cell phenotype and functionality in different forms of MS and during treatment with distinct disease modifying therapies (DMTs) has never been reported. Aim of our study was to evaluate the amount of iNKT in different forms of MS and following treatment with different immunomudulatory drugs, and to characterize their phenotype and functional activities in a cross-sectional study. In a longitudinal study we evaluated modifications in the amount of iNKT following initiation of DMTs, in a sub-group of patients who were followed up for one year. Immunological parameters were correlated with demographic and clinical data in all patients. Response to treatment was assessed on the basis of clinical and MRI activity.

One hundred sixty-five MS patients and 55 healthy controls were enrolled in this study. We characterized circulating iNKT cells (CD4+, CD8+, CD161++) and analyzed their cytokine production after in vitro stimulation (IL-17, TNF-α, IFN-γ, and IL-4). The frequency of iNKT cells was similar among patients with different forms and treatments of MS, but a T helper (Th) 1/Th17 cytokine bias were observed in MS patients. This was most prominent in SP patients, who displayed an increased production of interleukin (IL)-17 by CD4+ and CD8+ iNKT cells, suggesting that this form is characterized by sustained iNKT cell activation and skewing towards a steady pro-inflammatory phenotype. Furthermore, natalizumab (a monoclonal antibody targeting α4β1 integrin) modulated a reduction in iNKT cells producing Th1 and Th17 cytokines, seeming to inhibit their pro- inflammatory action.