From molecule to cell: investigation of DNA architecture by Atomic Force and Fluorescence microscopy

Abstract

Negli organismi viventi l’organizzazione spaziale dell’informazione genetica codificata nella molecola di acido desossiribonucleico (DNA), necessita del giusto equilibrio tra le caratteristiche fisiche della molecola e le esigenze biologiche della cellula. Il DNA è un polimero estremamente lungo se paragonato alle dimensioni della cellula e necessita quindi di un elevato grado di compattamento per essere contenuto all’interno dell’involucro cellulare. La compattazione del DNA, tuttavia, è in contrasto con il suo ruolo biologico in quanto svariate classi di enzimi devono avere accesso all’informazione per lo svolgimento dei processi vitali. Nelle cellule si instaura quindi un sistema regolativo che si estende dalla dimensione nanoscopica propria delle molecole che mediano i processi biologici a livello del DNA, fino alla dimensione microscopica degli organelli cellulari. Nel corso del dottorato mi sono occupato dello studio dell’organizzazione spaziale del DNA sia a livello molecolare che cellulare. In particolare mi sono occupato di due fattori trascrizionali di Helicobacter pylori, HpFur e HpNikR, che modulano l’architettura ed il grado di compattazione del DNA facilitando o ostacolando l’accessibilità della RNA polimerasi alla sequenza del promotore del gene arsR . I dati raccolti ci hanno permesso di sviluppare un modello molecolare nel quale in presenza di ferro HpFur è in grado multimerizzare e di indurre una compattazione di tutta la sequenza promotrice, impedendo in questo modo il legame della RNA polimerasi al DNA. In assenza di ferro invece, HpFur cambia la propria struttura quaternaria e lega una sequenza a monte del promotore consentendo il legame della RNA polimerasi al promotore. Il fattore trascrizionale HpNikR è in grado di legare il DNA solo in presenza di nichel ed è in grado di limitare la propagazione della compattazione del promotore, mediata da HpFur in presenza di ferro. Questo circuito regolativo permette a Helicobacter pylori di controllare finemente la sintesi di HpArsR a seconda della disponibilità dei cofattori metallici. Durante il dottorato mi sono anche occupato di valutare l’organizzazione tridimensionale dell’intero genoma dell’organismo modello Escherichia coli. A differanza di numero studi presenti in lettaratura, il mio studio si focalizzato sull’analisi delle proprietà’ meccaniche dell’intero genoma del batterio senza procede alla lisi della parete cellulare, perturbando quindi minimamente l’ambiente fisiologico in cui il nucleoide si organizza. Cellule di Escherichia coli sono state visualizzate in diverse fasi di crescita, dopo diverse procedure di essiccazione o sottoponendo le cellule a specifiche molecole intercalanti attraverso un procedura combinata AFM-FM. I dati ottenuti hanno permesso di correlare le modifiche morfologiche delle cellule con lo stato del nucleoide organizzato al loro interno. La medesima procedura di imaging è stato utilizzato anche nella caratterizzazione dei riarrangiamenti della membrana e del nucleoide di E. coli in seguito all’ espressione di un piccolo peptide (Lpt) idrofobico appartenente al sistema tossina-antitossina di tipo I di Lactobacillus rhamnosus. L’espressione della tossina causa una notevole rifrangimento morfologico generale della cellula, che si manifesta attraverso la formazione sulla membrana di strutture simili a fori e la compattazione del nucleoide batterico. I dati raccolti hanno dimostrato la natura tossica del peptide, evidenziandone la tendenza a danneggiare l’integrità strutturale di membrana.

In living organisms, the spatial organization of genetic information encoded in the molecule of deoxyribonucleic acid (DNA) requires the right balance between the physical properties of the molecule and the biological needs of the cell. DNA is an extremely long polymer when compared to the size of the cell and therefore it requires a high degree of compaction to be contained within the cell envelope. However, the compaction of DNA is at odds with its biological role as various classes of enzymes must have access to information for the development of vital processes. In cells, a regulatory system is thus established that extends from the nanoscopic dimension of the molecules that mediate biological processes at DNA level, to the microscopic dimension of cellular organelles. During my doctorate, I studied the spatial organization of DNA at both molecular and cellular levels. In particular, I have dealt with two transcriptional factors of Helicobacter pylori, HpFur and HpNikR, which modulate the architecture and the degree of compaction of DNA by facilitating or hindering the accessibility of RNA polymerase to the arsR gene promoter sequence. The data collected have allowed us to develop a molecular model in which, in the presence of HpFur iron, it is able to multimerize and induce a compaction of the entire promoter sequence, thus preventing the binding of RNA polymerase to DNA. In the absence of iron, however, HpFur changes its quaternary structure and binds a sequence upstream of the promoter, allowing the binding of RNA polymerase to the promoter. The transcription factor HpNikR is only able to bind DNA in the presence of nickel and is able to limit the propagation of promoter compaction, mediated by HpFur in the presence of iron. This control circuit allows Helicobacter pylori to finely control the synthesis of HpArsR depending on the availability of metal cofactors. During my PhD I also investigated the three-dimensional organization of the whole genome of the model organism Escherichia coli. With different number of studies in literature, my study focuses on the analysis of the mechanical properties of the entire genome of the bacterium without proceeding to the lysis of the cell wall, thus disturbing the physiological environment in which the nucleoid is organized. Escherichia coli cells have been visualized in different growth stages, after several drying procedures or by subjecting the cells to specific intercalating molecules through a combined AFM-FM procedure. The data obtained have allowed us to correlate morphological changes in cells with the state of the nucleoid organized inside them. The same imaging procedure was also used in the characterization of E. coli membrane and nucleoid rearrangements following the expression of a small hydrophobic peptide (Lpt) belonging to the toxin-antitoxin type I system of Lactobacillus rhamnosus. The expression of toxin causes a significant general morphological refraction of the cell, which manifests itself through the formation of hole-like structures on the membrane and the compaction of the bacterial nucleoid. The data collected have demonstrated the toxic nature of peptide, highlighting its tendency to damage the structural integrity of the membrane.