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dc.contributor.advisorCampanini, Barbara-
dc.contributor.authorCanosa, Andrea Valeria-
dc.date.accessioned2018-04-16T08:58:26Z-
dc.date.available2018-04-16T08:58:26Z-
dc.date.issued2018-03-07-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/1889/3504-
dc.description.abstractLa serina racemasi umana (hSR) è un enzima piridossal 5’-fosfato (PLP) dipendente che catalizza la racemizzazione reversibile dell’L-serina a D-serina e la β-eliminazione dell’L/D-serina a piruvato e ammoniaca nel cervello dei mammiferi. La D-serina è il principale co-agonista dei recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) e hSR potrebbe essere un target alternativo per controllare la concentrazione di questo amminoacido nel cervello. Lo scopo di questo lavoro è stato di studiare la dinamica di hSR con particolare attenzione per la regolazione allosterica da parte dell’ATP. Sono stati utilizzati due approcci: lo studio delle variazioni conformazionali indotte da ligandi tramite proteolisi limitata e la caratterizzazione del ruolo di alcuni residui amminoacidici nella comunicazione allosterica tra sito attivo e sito di legame dell’ATP. Nel primo caso è stato messo a punto uno studio di proteolisi limitata utilizzando tripsina. La cinetica di digestione della proteina è stata caratterizzata in assenza di ligandi, in presenza degli attivatori CaCl2, MgCl2, AMP-PCP (un analogo stabile dell’ATP) e degli inibitori malonato, glicina e NADH e analoghi strutturali. I polipeptidi ottenuti sono stati separati tramite SDS-PAGE e in alcuni analizzati mediante spettrometria di massa. L’addizione di CaCl2 o MgCl2 ha stabilizzato la proteina, mentre l’aggiunta di AMP-PCP non ha portato cambiamenti nel pattern di proteolisi. Questo risultato è in accordo con il dato cristallografico di SR di lievito in complesso con AMP-PCP che dimostra l’assenza di variazioni conformazionali in seguito a legame con il nucleotide. Il pattern di proteolisi limitata cambia invece quando l’AMP-PCP è addizionato insieme ad un ligando del sito attivo, come il malonato. L’analisi dei frammenti di proteolisi mediante spettrometria di massa ha permesso di identificare una regione della proteina, composta da una porzione del dominio maggiore e dall’intero dominio minore, che viene stabilizzata in presenza dei due ligandi. Questo risultato suggerisce che è stata isolata una conformazione di hSR in complesso con l’ATP e un ligando, rilevante per indagare i dettagli molecolari della regolazione allosterica dell’enzima. L’indagine sulla comunicazione allosterica tra sito attivo e sito dell’ATP è stata ulteriormente affrontata attraverso uno studio filogenetico combinato alla mutagenesi sito-specifica. Dall’analisi della struttura di SR di lievito in complesso con l’AMP-PCP, è stato identificato un network di legami a idrogeno, formato da cinque amminoacidi M53, N84, Q87, E281, N311 e molecole d’acqua, che connette il PLP e l’ATP. Questo collegamento potrebbe essere importante per la regolazione della struttura del sito attivo in presenza del ligando, che risulta nella stimolazione dell’attività di -eliminazione. Dal confronto di diverse sequenze di SR è stato osservato che si ha Q87 (89 in hSR) in quasi tutte e una A in SR di pianta, la cui attività non è regolata da nucleotidi. La Q è conservata in omologhi strutturali di SR la cui attività è regolata da nucleotide, quali le treonine deaminasi, ma non in serine deidratasi (SDH) che non sono controllate da nucleotidi e presentano una M. Per chiarire il ruolo di questo residuo il mutante Q89M è stato purificato e caratterizzato. In seguito a mutazione è stata osservata una quasi completa perdita della stimolazione dell’attività di β-eliminazione dell’L-Ser da parte dell’ATP. In Q89M-hSR il legame dell’ATP non è cooperativo come osservato per la proteina wt e l’affinità di legame è simile a quella misurata sulla conformazione ad alta affinità di hSR. La mutazione inoltre abolisce il cross-talk tra i siti attivo e allosterico, come dimostrato dagli effetti trascurabili del legame della glicina sull’affinità per l’ATP. Nel complesso questi dati hanno dimostrato che Q89 è un residuo chiave nella comunicazione allosterica tra il sito attivo e il sito di legame dell’ATP in hSR.it
dc.description.abstractHuman serine racemase (hSR) is a pyridoxal 5′-phosphate (PLP)-dependent enzyme which catalyzes the reversible racemization of L-serine to D-serine and the β-elimination of L/D-serine to pyruvate and ammonia in mammalian brain. D-serine is the main co-agonist of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors and hSR might be an alternative target to control the amount of this amino acid in the brain. The focus of this work was to study the dynamics of hSR with emphasis on the allosteric regulation by ATP. Two complementary approaches have been used: the study of the conformational changes induced by ligands of the protein through limited proteolysis and the characterization of the role of key amino acids in the allosteric communication between the active site and the ATP binding site. The first task was addressed by a limited proteolysis approach using trypsin. A time course experiment was carried out, in absence of ligands and, in presence of either activators such as CaCl2, MgCl2, AMP-PCP (an ATP stable analogues) or inhibitors such as malonate, glycine, NADH and its structural analogues. The obtained polypeptides have been separated by SDS-PAGE and in some instances analyzed by mass spectrometry. The addition of CaCl2 o MgCl2 led to protein stabilization, while addition of AMP-PCP didn’t lead to any significant variation in the proteolytic pattern. A different proteolytic pattern has been obtained after the addition of AMP-PCP and an active site ligand, such as malonate. The analysis of the proteolytic fragments using mass spectrometry allowed to identify a protein region stabilized by the two ligands, comprising a part of the large domain and all the small domain. Thus a conformation has been isolated which might be relevant to the molecular understanding of the allosteric regulation of the enzyme. The study of the allosteric communication between the active site and the ATP binding site has been further carried out through a phylogenetic study combined with site-specific mutagenesis. From the analysis of yeast SR structure in complex with AMP-PCP, a hydrogen bond network that connects PLP and ATP composed of M53, N84, Q87, E281, N311 and water molecules, has been identified. This connection may be important for the active site structure regulation in presence of the ligand, resulting in the stimulation of β-elimination activity. The comparison of different SR sequences showed that Q87 (Q89 in human sequence numbering) is conserved in almost all SR sequences, but is mutated in an A in plant SR, whose activity is not regulated by nucleotides. Moreover this residue is conserved in bacterial threonine deaminases, that are structural homologues of SR regulated by nucleotides, but not in mammalian serine dehydratase (SDH), whose activity is not regulated by nucleotides. In SDH the position corresponding to Q89 is occupied by a M. To clarify the role of this residue the mutant Q89M has been purified in soluble form and characterized. The mutation leads to an almost complete loss of ATP stimulation of L-Ser β-elimination. In Q89M-hSR the ATP binding is not cooperative and the binding affinity is similar to the one measured for the high affinity conformation of hSR. In addition the mutation abolishes the cross-talk between active site and allosteric site, as it was shown by the negligible effect of glycine binding on ATP affinity. Overall these data showed that Q89 is a key residue in the allosteric communication between active site and ATP binding site in hSR.it
dc.language.isoItalianoit
dc.publisherUniversità di Parma. Dipartimento di Scienze degli Alimenti e del Farmacoit
dc.relation.ispartofseriesDottorato di ricerca in scienze del farmaco, delle biomolecole e dei prodotti per la saluteit
dc.rights© Andrea Valeria Canosa, 2018it
dc.subjectserine racemaseit
dc.subjectdynamicsit
dc.titleDinamica e regolazione allosterica dell'enzima umano serina racemasiit
dc.title.alternativeDynamics and allosteric regulation of the human enzyme serine racemaseit
dc.typeDoctoral thesisit
dc.subject.miurBIO/10it
Appears in Collections:Scienze del farmaco, delle biolomolecole e dei prodotti per la salute, tesi di dottorato

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