Bovine β-Casein: source of Betacasomorphin-7 with effect on human health. Genomic Imputation between A2 β-Casein variant and other phenotypic traits

Abstract

La caseina del latte è suddivisa in 4 frazioni principali - αS1-Cn, αS2-Cn, β-Cn e k-Cn - che rappresentano circa l'80% della proteina totale nel latte vaccino. I geni codificanti le 4 frazioni caseiniche sono organizzati in un cluster di 250bp sul cromosoma 6 del genoma bovino. Le caseine hanno diverse varianti genetiche legate a mutazioni a livello di DNA che, nella maggior parte dei casi, causano delle sostituzioni amminoacidiche nella proteina matura. La frequenza, delle diverse varianti genetiche delle caseine, cambia notevolmente nella popolazione bovina. Alcune di queste varianti, sono in grado di influenzare positivamente o negativamente caratteristiche quantitative e/o qualitative del latte vaccino. Le caseine possono essere fonti di biopeptidi, ossia brevi frammenti amminoacidici con una potenziale azione biologica nei processi metabolici. I biopeptidi si formano durante il processo digestivo della proteina matura come conseguenza dell’azione proteolitica degli enzimi digestivi. Questa tesi si concentra sulla β-Cn e su due delle sue tredici varianti genetiche, vale a dire la variante A1 e quella A2. Le due varianti si differenziano l'una dall'altra per la sostituzione di una Pro (variante β-Cn A2) da una His (variante β-Cn A1) in posizione 67 della proteina matura. L'istidina in posizione 67 nella variante A1 rende il legame peptidico tra Ile66-His67 più sensibile all'azione proteolitica degli enzimi digestivi rispetto a quello tra Ile66- Pro67 della variante A2. Ciò promuove il rilascio di un particolare biopeptide, la beta casomorphin-7 (BCM7, Tyr60-Pro61-Phe62-Pro63-Gly64-Pro65-Ile66), dalla variante A1. BCM7 è un biopeptide con azione morfino-simile, agonista esogeno dei recettori μ, presenti a livello del sistema nervoso centrale e periferico, del sistema immunitario e anche a livello intestinale. Alla luce di questa caratteristica, diversi studi hanno ipotizzato il suo coinvolgimento nello sviluppo di patologie umane. Tuttavia, il report dell'EFSA del 2009 “Review of the potential health impact of beta-casomorphins and related peptides” ha confermato l'azione negativa della variante β-Cn A1 e della BCM7, solo sulla motilità intestinale e sulle secrezioni gastriche e pancreatiche. L’introduzione di questa tesi di dottorato è un esame approfondito degli studi condotti sull'effetto di β-Cn A1 sulla salute umana, dal 2009 (dopo il Report EFSA) fino ad oggi. Nonostante gli effetti della β-Cn A1 sulla salute umana non siano stati ancora ben chiariti, sin dal 2000 è possibile trovare nei supermercati prodotti ottenuti da latte di vacche omozigoti A2A2 per il locus della β-Cn, produttrici, quindi, di latte contenente solo la variante β-Cn A2. In seguito al successo commerciale di questo tipo di prodotto, anche in Italia molte aziende del settore hanno iniziato a commercializzare (o ne stanno valutando la possibilità) latte di vacche omozigoti β-Cn A2A2. Dal punto di vista scientifico, è importante stimare l'impatto della selezione degli animali omozigoti A2A2 al locus della β-Cn (CSN2) sugli altri caratteri qualitativi e quantitativi del latte. A tal riguardo, la parte sperimentale di questa tesi di dottorato si focalizza sulla valutazione dell'associazione (LD, Linkage Disequilibrium), a livello di DNA, attraverso uno studio di GWAS (Genome Wide Association Study), dell’allele CSN2 * A2 con: (i) l’allele B della k-Cn (CSN3*B) – visto gli effetti positivi di questo allele sulle caratteristiche del latte vaccino destinato alla caseificazione - in tori delle razze Bruna, Frisona e Simmental. (ii) SNPs (Singole Nucleotide Polimorphysms) posizionati 10Mb a monte e 10Mb a valle dalla mutazione caratterizzante l’allele CSN2*A2, in tori interamente sequenziati (WGS-Whole Genome Sequencing) appartenenti alle razze, Bruna, Frisona e Simmental. (iii) Identificazione degli SNPs posti a 10Mb a monte e 10Mb a valle della mutazione che caratterizza CSN2 * A2 con effetto significativo su alcuni caratteri oggetto di selezione in tori WGS, quindi cin genoma interamente sequenziato, di razza Frisona. I caratteri considerati sono stati la produzione di latte (MY), la produzione di proteina (PY), la produzione di grasso (FY), la percentuale di proteina (PP), la percentuale di grasso (FP) e il valore delle cellule somatiche (SCS). Di seguito sono riportati, in breve, i risultati ottenuti nelle diverse fasi di analisi: (i) Uno studio preliminare è stato condotto per verificare l'equilibrio di Hardy-Weinberg tra i due alleli (CSN2*A2 e CSN3*B) in 105, 450 e 274 tori, rispettivamente, delle razze Bruna, Frisona e Simmental. I risultati hanno confermato un’associazione preferenziale significativa tra CSN2*A2 e CSN3*B nei tori di razza Bruna. Tuttavia, il basso numero di tori di razza Bruna analizzati (solo 105) non consentiva di confermare l'ipotesi di genetic draft. Per questo motivo, lo studio è stato esteso a quasi 600 tori di razza Bruna genotipizzati per i loci CSN2 e CSN3. Questa successiva analisi ha confermato l'ipotesi di associazione preferenziale e l’effetto genetic draft tra CSN3*B e CSN2*A2 nella razza Bruna. (ii) I dati di tori WGS, sono stati esaminati per identificare altre possibili varianti di marcatori SNPs associati con CSN2*A2. In Simmental, gli SNPs localizzati a maggiore distanza, con un elevato LD (r2≥0.5), sono stati rivelati a 110Kb dalla mutazione caratterizzante CSN2*A2. Nei tori di razza Frisona è stato osservato un risultato analogo, anche se a 3Mb a valle della mutazione sono stati individuati diversi SNPs in elevato LD con CSN2*A2, ma nessuno di questi era presente all’interno di un gene. In Simmental il blocco di LD è risultato essere più corto, questo potrebbe essere dovuto allo schema di selezione usato per questa razza, diverso rispetto a quello in uso per la razza Frisona focalizzato sulla produzione di latte. Nei tori di razza Bruna, invece, è stata identificata una regione di LD molto estesa situata a valle dalla mutazione causativa. Tuttavia, il numero limitato di animali utilizzati nelle analisi ha probabilmente distorto il segnale, aumentando il livello di LD e non mostrando un quadro affidabile della situazione. In ogni caso, in questa razza è evidente l’impatto della recente selezione nella regione con LD più elevato. Per ogni razza esaminata, i markers SNPs trovati a monte e a valle della regione della mutazione causativa, con r2 maggiore di 0,5, sono stati identificati tramite analisi VEP (Variant Effect Predictor). Questi SNPs non sembrano avere forti conseguenze sugli open reading frames codificanti per le proteine (cioè non sono codoni di stop, varianti missense, etc.) (iii) Come risultato finale in seguito ad un analisi di GWAS, un tag-SNP per la mutazione causativa del polimorfismo A1 / A2, è stato rilevato nelle varianti presenti nel dataset BovineHD. Solo queste varianti sono state estratte dai dati WGS ed è stata eseguita l’analisi di LD. Il tag-SNP selezionato, cioè SNOV BovineHD4100005296 (posizione 87.180.731), mostra un livello di LD (r2) con la mutazione causativa di 1, 1, 0,97, rispettivamente, in Bruna, Frisona e Simmental. Solo per SNPs in grado di influenzare i caratteri PP e SCS sono state osservate associazioni con il tag di CSN2*A2 oltre la soglia di significatività di Bonferroni stabilita. I risultati ottenuti in questo studio mostrano un’associazione significativa in Bruna tra gli alleli CSN2*A2 e CSN3*B ,confermando i risultati precedenti. Nella razza Bruna, grazie all'effetto hitchhiking, la variante A2 di β-Cn sarebbe selezionata indirettamente selezionando per la variante B della k-Cn. Nella razza Frisona, al contrario, non è stato osservato un alto LD tra i due alleli considerati, come osservato, peraltro, anche nella razza Simmental. Inoltre, nella regione (± 10Mb) non è stata riscontrata la presenza di nessun’associazione (quindi nessun LD sufficientemente alto) tra CSN2*A2 e SNPs con effetto sui caratteri della produzione di latte.

The principal 4 casein fractions - αS1-Cn, αS2-Cn, β-Cn e k-Cn - represent about 80% of total protein in bovine milk. The coding genes are organized in a cluster of 250bp on chromosome 6 of the bovine genome. Caseins have several genetic variants due to mutations at the DNA level causing in most cases amino acid substitutions in the mature protein. The frequency of caseins genetic variants differs across bovine populations and influence positively and/or negatively milk production and quality. Caseins are also source of biopeptides. These are short stretch of amino acids with potential biological function that are released by the activity of proteolytic enzymes during the digestive process of the native proteins. This thesis focuses on β-Cn and on 2 of its 13 genetic variants, namely A1 and A2. These two variants differ from each other for the substitution of a Pro (A2 variant) by a His (A1 variant) on position 67 of the mature protein. Histidine in position 67 makes the A1 more vulnerable to the proteolytic action of digestive enzymes, causing the release of a particular biopeptide: the beta casomorphin-7 (BCM7, Tyr60-Pro61-Phe62-Pro63-Gly64-Pro65-Ile66) mainly from β-Cn A1. BCM7 is a biopeptide with a morphine-like action, an external agonist for μ receptors. Because of this characteristic, several studies hypothesized the involvement of A1 variant and BCM7 on the development of human pathologies. However, the EFSA’s report of 2009 “Review of the potential health impact of beta-casomorphins and related peptides” confirms the influence of BCM7 only on the intestinal motility and on the gastric and pancreatic secretions. Studies performed on the effect of β-Cn A1 from the report EFSA (2009) to date, were reviewed in the introduction of this PhD thesis. Despite the possible negative effect of β-Cn A1 has not been proved yet, since the early 2000 years it is possible to find on the market products made with milk of homozygous A2A2, cows at the β-Cn locus (CSN2), thus producing milk with only β-Cn A2. As the commercial success of this kind of product, also in Italy many milk companies start the production (or are evaluating the possibility) of milk obtained from β-Cn A2 cows. From the scientific point of view, it is important to evaluate the impact of selecting animals homozygous A2A2 at CSN2 on other milk traits. In this concern, the experimental section of this thesis was focused on assessing the association at DNA level (linkage disequilibrium, LD), using the GWAS (Genome Wide Association Study) analysis, of the CSN2*A2 allele with: (i) the allele B of the k-Cn locus (CSN3*B) – as the positive effect of this variant on milk processing properties - in bulls from Brown, Holstein and Simmental cattle breeds; (ii) single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) positioned 10Mb upstream and 10Mb downstream the mutation characterising CSN2*A2, in Whole Genome Sequencing (WGS) bulls from Brown, Holstein and Simmental cattle breeds; (iii) SNPs positioned 10Mb upstream and 10Mb downstream the mutation characterising CSN2*A2 with a significant effect on some important milk traits, in WGS Holstein bulls. The traits considered were milk yield (MY), protein yield (PY), fat yield (FY), protein percentage (PP), fat percentage (FP) and somatic cells score (SCS). The results are reported below. (i) A preliminary study was carried testing the Hardy-Weinberg equilibrium analysing the genotypes of 105, 450 and 274 whole genome sequenced bulls from Brown, Holstein and Simmental Type cattle breeds, respectively. Results confirmed the LD between CSN2*A2 and CSN3*B only in Brown. The analysis was then extended to almost 600 Brown bulls genotyped at the CSN2 and CSN3 loci and genetic draft between CSN2*A2 and CSN3*B in Brown cattle was confirmed. (ii) The WGS data were also explored to identify other possible hitchhiking variants with CSN2*A2. The farther SNPs in high LD (r2≥0.5) in Simmental were 110 Kb from CSN2*A2 characterizing mutation. In Holstein cattle breed there was a similar behaviour, but at 3Mb downstream there was a LD island where no one of the high LD SNPs alleles was inside a gene. In Simmental the smaller LD block could indicate a different selection scheme compared to Holstein breed. In Brown cattle breed the situation was different, with a very high LD SNPs zone in the downstream side. The limited number of animals used in the analyses probably distorted the signal, increasing the level of LD and not showing the right picture. However, it is evident the different impact of recent selection in the region with a higher LD block in Brown cattle breed. For each cattle breed, the SNP alleles in the 10Mb upstream and downstream regions with r2 greater than 0.5 were investigated troughs VEP (Variant Effect Predictor). These SNP alleles did not seem to have strong consequences on the open reading frames coding for proteins (i.e. stop codon, deleterious missense variants, etc…). (iii) Firstly, a tag-SNP for the causative mutation of A1/A2 polymorphism was detected in the BovineHD available variants. Only the variants available in the genotype dataset were extracted from the WGS data and an LD analyses was performed. The selected tag-SNP BovineHD4100005296 (position 87,180,731) shows a level of LD (r2) with causative mutation of 1, 1, 0.97 in Brown, Holstein and Simmental Type cattle breed, respectively. Only PP and SCS showed SNP markers over the Bonferroni established threshold. The results obtained in this study show a significant association between the alleles CSN2*A2 and CSN3*B in Brown cattle breed, confirming previous results. In Holstein cattle breed could be not possible increasing the frequency of β-Cn A2 variant selecting for k-Cn B, because a linkage between the two variants was not observed in this breed. A similar behaviour in Simmental cattle breed has been noticed. No LD between CSN2*A2 and SNPs affecting milk traits - in the region ±10Mb from the mutation characterizing CSN2*A2 - was observed.