Interazione tra virus influenza e cellula ospite: ruolo del citoscheletro cellulare nella determinazione di una condizione di resistenza all’infezione virale

Abstract

Il lavoro sperimentale oggetto di questa tesi è volto a mettere in luce l’intervento di una componente cellulare, il citoscheletro, nella regolazione dell’infezione sperimentale della linea cellulare LLC-MK2 (rene di scimmia) con stipiti di virus influenza A. Le cellule LLC-MK2 costituiscono un modello semi-permissivo per il virus influenza, nel caso si utilizzi un inoculo virale a bassa molteplicità, e, pertanto, sono funzionali a svelare meccanismi di resistenza cellulare all’infezione virale. L’obiettivo principale è stato quello di appurare l’intervento di funzioni/componenti regolatorie dei sistemi citoscheletrici dei microtubuli e dei microfilamenti in corso di infezione con stipiti di virus influenza A (H1N1) nelle cellule LLC-MK2. L’attenzione è stata inizialmente focalizzata sul ruolo svolto dai proteasomi nella regolazione dei microtubuli e sulle ripercussioni esercitate sull’infezione virale. I risultati ottenuti attestano una diminuzione di espressione di alpha-tubulina acetilata, principale componente dei microtubuli in assetto stabilizzato, a seguito dell’attivazione delle funzioni proteolitiche dei proteasomi con la sostanza IU1; viceversa, è stato appurato un aumento dell’espressione della suddetta proteina, in conseguenza dell’inibizione dei proteasomi con la sostanza MG132. Le suddette modificazioni di assetto dei microtubuli correlavano con modulazioni dell’infezione del virus influenza. Più precisamente, l’efficienza del ciclo replicativo virale dello stipite umano NWS/33 e dello stipite aviare Mallard/03 di virus influenza A aumentava in condizioni di attivazione dei proteasomi, mentre diminuiva in seguito all'inibizione dei proteasomi. Inoltre, mediante microscopia confocale, è stata dimostrata la parziale co-localizzazione dei proteasomi con la nucleoproteina virale e con componenti dei microtubuli stabili. In particolare, il segnale di co-localizzazione era di maggiore entità nelle cellule infettate, dove sono stati osservati dei rilevanti cambiamenti nella distribuzione citoplasmatica delle proteine alpha-tubulina e MAP4. Tali risultati depongono per l’intervento dei proteasomi nella modulazione dei microtubuli nelle cellule LLC-MK2 infettate con il virus influenza, tuttavia l’azione regolatoria esercitata potrebbe essere di tipo indiretto e coinvolgere dei meccanismi di segnalazione intracellulare mediati dai microtubuli. È, inoltre, stato appurato che la depolimerizzazione dei microtubuli e dei microfilamenti con sostanze chimiche induce delle modificazioni reciproche dell’assetto di tali componenti, che “interagiscono” tra loro e svolgono un’azione sinergica, quali fattori di restrizione cellulare nei confronti di fasi precoci dell’infezione virale nelle cellule LLC-MK2. L’attenzione è stata successivamente rivolta all’intervento della proteina omologa alla proteina diafano 1 di Drosophila (DIAPH1), che regola le funzioni dei microtubuli e dei microfilamenti. Nelle cellule LLC-MK2 sottoposte a silenziamento del gene che codifica per la proteina DIAPH1 ed infettate con il virus influenza A/NWS/33 è stato osservato un aumento della produttività dell’infezione virale, unitamente a modificazioni di assetto dei microtubuli, che erano contraddistinti da una diminuita espressione di alpha- e beta-tubulina ed un’estensione ad un’area citoplasmatica più ampia, e dei microfilamenti, che erano caratterizzati da una diminuita espressione dell’actina filamentosa. L’osservazione di una localizzazione subcellulare e di un livello di espressione altamente variabili della proteina DIAPH1 in corso di infezione del virus NWS/33 nelle cellule LLC-MK2, depone per funzioni regolatorie svolte dalla proteina in specifici distretti subcellulari. Ulteriori modificazioni sono state osservate a seguito della depolimerizzazione dei microtubuli e dei microfilamenti, che depongono per l’esistenza di “interazioni” tra la proteina DIAPH1 e tali componenti del citoscheletro. L’analisi in microscopia confocale ha evidenziato, nelle cellule LLC-MK2 infettate, la parziale co-localizzazione della proteina DIAPH1 con actina, alpha-tubulina acetilata, beta-tubulina e la nucleoproteina virale. In particolare, la co-localizzazione con le componenti del citoscheletro era di entità maggiore, oltre che appannaggio di differenti aree citoplasmatiche, nelle cellule LLC-MK2 infettate, rispetto a quelle non infettate. Infine, l’analisi è stata estesa a cellule dell’epitelio respiratorio umano positive per il virus influenza A, oppure per il virus respiratorio sinciziale; tali cellule derivavano da tamponi faringei e nasali di soggetti ricoverati od osservati ambulatorialmente e pervenuti presso l’Unità Operativa di Virologia dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma per la diagnosi di laboratorio di infezione da virus dell’apparato respiratorio. In particolare, nelle cellule positive per il virus influenza A, l’espressione della proteina DIAPH1 risultava accentuata e, al contrario, in quelle positive per il virus respiratorio sinciziale, era di scarsa entità. I risultati conseguiti rendono ragione dell’elevata complessità del rapporto che intercorre tra virus influenza e cellula ospite e pongono l’accento sulla stretta correlazione con aspetti morfologico-funzionali della cellula infettata. Le osservazioni sperimentali ottenute rafforzano le conoscenze sul fatto che la stabilizzazione dei microtubuli e la polimerizzazione dei microfilamenti, alla cui regolazione partecipano i proteasomi e la formina DIAPH1, possa concorrere in maniera significativa alla modulazione dell’infezione del virus influenza A nelle cellule LLC-MK2.