Ruolo della proteina adenilato ciclasi solubile nel danno indotto da riperfusione in cellule cardiache

Abstract

L’alterazione delle funzioni mitocondriali indotta da stress e invecchiamento comporta la perdita dell’omeostasi cellulare e della salute dell’organismo. La funzione mitocondriale è altamente dipendente dall’espressione e attività delle proteine appartenenti al sistema della fosforilazione ossidativa (OXPHOS). I meccanismi che controllano l’attività di tale sistema sono per lo più sconosciuti. Studi recenti mettono in evidenza un ruolo chiave del signaling mitocondriale di cAMP/PKA nel controllo dell’attività di OXPHOS grazie alla fosforilazione di diverse subunità del complesso I e IV. È stato dimostrato che i mitocondri posseggono una fonte propria di cAMP, ovvero l’enzima adenilato ciclasi solubile (sAC). Lo ione Ca2+ e bicarbonato promuovono l’attivazione di sAC. Di conseguenza, in tessuti od organi ad alta richiesta di energia come il cuore, l’attivazione della sAC mitocondriale potrebbe essere particolarmente importante per promuovere la produzione di ATP in quelle condizioni patologiche in cui il normale rifornimento di energia è perturbato, come avviene durante ischemia/riperfusione (I/R). In questo progetto di tesi è stato studiato il ruolo di sAC nel danno indotto da riperfusione in cellule cardiache. A questo scopo, gli strumenti di soppressione farmacologica di sAC con l’inibitore specifico KH7, stimolazione di sAC con bicarbonato, e overespressione di sAC sono stati applicati in cardiomiociti di ratto adulto e cardiomioblasti di ratto embrionali (H9C2) sottoposti a esperimenti di simulata I/R. In entrambi i tipi cellulari, sono stati analizzati l’aumento della concentrazione di Ca2+, l’ipercontrazione e la morte cellulare indotti da riperfusione. I risultati di questa tesi dimostrano che l’inibizione dell’attività di sAC in entrambi i tipi cellulari incrementa il danno indotto da riperfusione. Al contrario, il supporto dell’attività di sAC con bicarbonato, durante ischemia e riperfusione o durante la sola riperfusione, preserva significativamente la vitalità dei cardiomiociti. Inoltre, promuovendo l’attività di sAC nei mitocondri, tramite overespressione in cellule H9C2, viene considerevolmente ridotto il danno da riperfusione. In conclusione, l’attività basale di sAC è importante durante la riperfusione per sostenere la ripresa dei cardiomiociti dall’insulto ischemico. La stimolazione di sAC durante la riperfusione preserva ulteriormente la vitalità cellulare. I risultati di questa tesi aprono prospettive per lo sviluppo di nuove strategie nella protezione del miocardio dalla morte cellulare derivata dall’insulto post-ischemico.

Aging- or stress-induced decline in mitochondrial function leads to a loss of cellular homeostasis and organismal health. Mitochondrial function is highly dependent on the expression and activity of proteins of the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system. The mechanisms controlling activity of OXPHOS system are largely unknown. Recent evidence emphasized a role of mitochondrial cAMP/PKA signaling in promoting mitochondrial OXPHOS activity and ATP synthesis due to PKA-dependent phosphorylation of several subunits of the complex I and IV. It has been also shown that mitochondria possess an own source of cAMP, i.e., the type 10 soluble adenylyl cyclase (sAC). Ca2+ and bicarbonate promote sAC activity. Accordingly, in high-rate energy consuming tissues or organ, such as the heart, mitochondrial sAC activity might be particularly important to support the ATP synthesis in those pathological conditions where the energy homeostasis is disrupted, e.g., under ischemia/reperfusion (I/R). Therefore, in the present thesis the role of sAC in reperfusion-induced injury of cardiac cells was investigated. For this purpose, the pharmacological suppression of the sAC activity with specific inhibitor KH7, sAC stimulation with bicarbonate, and sAC overexpression were applied in adult rat cardiomyocytes and rat embryotic cardiomyoblasts (H9C2) subjected to simulated I/R. In both cell types reperfusion-induced injury, i.e., Ca2+ overload, hypercontracture, and necrotic cell death were analyzed. The data of this thesis demonstrate that inhibition of sAC activity in both cell types enhances reperfusion-induced injury. In contrast, supporting sAC activity with bicarbonate during ischemia and reperfusion or during reperfusion alone significantly preserves cardiomyocytes viability. Importantly, promoting sAC activity in mitochondria by targeted sAC overexpression in H9C2 cells markedly reduced reperfusion-induced injury. In conclusion, during reperfusion the basal activity of sAC is important to support recovery of cardiomyocytes from ischemic insult. Stimulation of sAC during reperfusion further preserves cell viability. The data of the present thesis open perspectives for the development of new strategies effectively fighting post-ischemic cell death.