Genotossicologia di Nanomateriali Ingegnerizzati (ENMs): l’esperienza e i risultati di un confronto di analisi genome-wide in lievito e in pianta.

Abstract

I nanomateriali ingegnerizzati (ENMs) sono strutture nell’ordine degli 1-100 nm, e sono caratterizzati da proprietà, dovute alle loro ridotte dimensioni e alla reattività superficiale, che li rendono adatti ad un ampia gamma di applicazioni industriali. Le nanotecnologie sono un’industria in rapida crescita, con un valore di mercato che si prevede raggiungerà i 49 miliardi di dollari entro il 2017 (Nanotechnology Market Outlook 2017, RNCOS, Maggio 2013). A causa della loro ampia diffusione e della mancanza di informazioni relativamente ai meccanismi di assorbimento negli organismi e di interazione a livello cellulare, diventa cruciale determinare i rischi legati alla loro dispersione e comportamento nell’ambiente. Una prima parte del lavoro è stata effettuata in piante, seguendo uno studio precedente svolto su Arabidopsis thaliana (Marmiroli et al. 2014), in cui l’analisi trascrittomica condotta su due linee mutate tramite mutagenesi inserzionale di un trasposone Ds ha consentito di identificare i geni coinvolti nella tolleranza al trattamento con quantum dots a base di cadmio solfuro (CdS QDs). Partendo da qui, in cooperazione con il CAES di New Haven, CT, il lavoro si è focalizzato sull’impatto dei nanomateriali sulla pianta di interesse agroalimentare Cucurbita pepo. Cinque differenti nanomateriali (CeO2, La2O3, CuO, ZnO, e CdS QDs) sono stati testati singolarmente ed a coppie per determinare come l’interazione fra le differenti nanoparticelle possa influire sull’espressione genica e sull’assorbimento e traslocazione all’interno dei tessuti della pianta. L’analisi di espressione tramite Real Time PCR ha identificato diversi geni che rispondono in modo specifico a ciascuno dei nanomateriali analizzati; in particolare, il gene 152u, che codifica per un trasportatore di elettroni cloroplastico, risulta essere down-regolato in tutte le condizioni di trattamento, e rappresenta quindi un putativo marcatore di selezione. L’analisi tramite ICP-MS del contenuto di metalli ha mostrato che i nanomateriali sono più facilmente traslocati negli steli e nelle foglie rispetto alla loro controparte non nanometrica, probabilmente a causa delle loro minori dimensioni. Lo scopo della seconda parte del lavoro è stato invece quello di analizzare l’effetto dei CdS QDs nell’organismo modello Saccharomyces cerevisiae, sfruttando tecniche high-throughput di genomica e trascrittomica: la prima consiste nell’analisi di una libreria di circa 6000 mutanti aploidi deleti in ciascuno dei geni non essenziali di lievito; la seconda consiste invece nell’analisi dell’intero trascrittoma tramite la piattaforma microarray Affymetrix GeneChip. Un’analisi di gene ontology e delle reti di interazione ha permesso di identificare l’organizzazione mitocondriale e la mitosi come due dei principali processi biologici influenzati dall’azione dei CdS QDs. In particolare, i dati ottenuti hanno permesso di evidenziare i differenti meccanismi d’azione dei quantum dots e dello ione cadmio, mentre HSC82, ALD3 e DSK2 sono stati identificati come geni chiave coinvolti nella risposta ai CdS QDs (Marmiroli et al. 2016). L’effetto dei quantum dots sui mitocondri è stato quindi studiato da un punto di vista fisiologico e morfologico: i) l’attività respiratoria è stata compromessa; ii) il potenziale di membrana è stato distrutto; iii) la microscopia di fluorescenza ha evidenziato un’interruzione nella network mitocondriale; iv) in seguito al trattamento, la cellula ha accumulato specie reattive dell’ossigeno, mentre lo stato redox del glutatione è diminuito significativamente; v) il trattamento con CdS QDs ha compromesso la capacità del lievito di crescere su terreno contenente una fonte di carbonio non fermentabile ma, a differenza del cadmio in forma ionica, non ha indotto la formazione di mutanti respiratorio deficienti (Pasquali et al. 2016).

Engineered nanomaterials (ENMs) are structures on the range of 1-100 nm, and are characterized by properties due to their small size and surface reactivity that make them suitable for several industrial applications. Nanotechnology is a rapidly growing industry, with a market value expected to reach US$ 49 billion by 2017 (Nanotechnology Market Outlook 2017, RNCOS, May 2013). Because of their wide diffusion and of the lack of information about mechanisms of biological uptake and interaction with cells, it’s crucial to assess the risks linked to their spread and behaviour in the environment. A first part of this work was performed in plants, following a previous experience with Arabidopsis thaliana (Marmiroli et al. 2014), in which transcriptomic analysis on two Ds transposition-induced mutant lines allowed the identification of genes involved in tolerance to cadmium sulphide quantum dots (CdS QDs). Starting from here, in cooperation with CAES of New Haven, CT, the work focused on the impact of nanomaterials on crop plant Cucurbita pepo. Five different nanomaterials (CeO2, La2O3, CuO, ZnO, and CdS QDs) were tested singularly and in couples to determine how the interaction between different NPs could alter their effect on the transcriptome and their uptake and translocation inside plant tissues. Real-time expression analysis identified several genes that specifically respond to each of the nanomaterials tested; in particular the gene 152u, encoding for a chloroplastic electron carrier, is down-regulated in all the treatment conditions, thus representing a putative biomarker of exposure. ICP-MS analysis of metal content showed that nanomaterials are more easily translocated in stems and leaves than their bulk counterparts, probably because of their smaller size. The aim of the second part of this work was to analyse the effect of CdS QDs in the model system Saccharomyces cerevisiae, exploiting high-throughput genomic and transcriptomic approaches: the former consisted in screening a collection of 6000 haploid strains, with a deletion in genes that are not essential for yeast’s survival; the latter consisted in a whole-transcriptome analysis of expression levels through Affymetrix GeneChip Microarray platform. A gene ontology and network analysis was performed on the data obtained, allowing the identification of mitochondrial organization and mitosis as the main biological processes affected by CdS QD action. In particular, data collected highlighted the differences between CdS QDs and Cd2+ mechanisms of toxicity, while HSC82, ALD3 and DSK2 were identified as some of the key genes involved in CdS QDs response (Marmiroli et al. 2016). The impact of quantum dots on mitochondria was then studied from a physiological and morphological point of view: i) the respiratory activity was impaired; ii) mitochondrial membrane potential was disrupted iii) fluorescence microscopy highlighted an interruption in the mitochondrial network; iv) upon treatment, reactive oxygen species accumulation was induced, while the glutathione redox-state decreased significantly; v) CdS QD treatment impaired the ability of yeast cell to grow on non-fermentable carbon sources but, conversely from ionic cadmium, did not induce the formation of respiratory deficient mutants (Pasquali et al. 2016).