Protein-based nanostructures as carriers for photo-physically active molecules in biosystems

Abstract

In nature, many proteins function as carriers, being able to bind, transport and possibly release a ligand within a biological system. Protein-based carriers are interesting systems for drug delivery, with the remarkable advantage of being water-soluble and, as inherent components of biosystems, highly bio-compatible. This work focuses on the use of protein-based carriers for the delivery of hydrophobic photo-physically active molecules, whose structure and chemical properties lead to spontaneous association of the two components. The self-assembly of stable nanostructures formed by the combination of the protein and the photo-active molecule was assessed spectroscopically. It was demonstrated that the association with the carrier generally induce an improvement of the photo-physical activity of the compounds under physiological conditions, by preventing aggregation of the compounds. The behavior of the nanostructures was then analyzed in the presence of bacterial cells in suspension or cultured tumor cells. Preventing aggregation is particularly important for photosensitizing molecules (PS). When photo-excited, these molecules react with the molecular oxygen present in solution, leading to the generation of cytotoxic reactive oxygen species in a reaction called photosensitization, which is exploited to inactivate pathogen microbes or tumor cells. The efficacy of the photosensitization-based inactivation of cells induced by the PS delivered with the protein-based carrier was evaluated in relation with the photo-physical parameters and correlated to the images collected with fluorescence microscopy techniques. Additionally, the increased fluorescence emission from the protein-bound PS Hypericin was successfully exploited for imaging the cellular distribution of this molecule with subdiffraction resolution by means of super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy. Some clear advantages in the use of protein-based carrier for the delivery of PSs have been identified for the photo-treatment of cells, in comparison with the unbound PS. Photo-active metal-organic compounds belonging to the class of so-called triplet emitters were also investigated for their potential as luminescent reporters for bio-imaging techniques. The major problem concerning the use of these compounds is related to their poor spectroscopic stability, due to hydrophobic aggregation. It was successfully demonstrated that the combination with a protein carrier allows to overcome this problem and to obtain a stable, water-soluble, minimally-invasive system, suitable as luminescent probe that is potentially useful for bio-imaging.

In natura un gran numero di proteine ha funzione di trasporto, essendo in grado di legare, trasportare ed eventualmente rilasciare un ligando all’interno di un sistema biologico. Seguendo un approccio caratteristico della nano-medicina, queste proteine di trasporto possono essere viste come interessanti sistemi di drug delivery, caratterizzati dall’essere ben solubili in acqua e altamente bio-compatibili, in quanto basate su proteine che sono spontaneamente presenti nei bio-sistemi. Questo lavoro ha riguardato l’utilizzo di sistemi proteici per il trasporto di molecole attive dal punto di vista foto-fisico, prevalentemente a carattere idrofobico, la cui struttura e le cui proprietà chimiche fossero compatibili con il legame sulla struttura proteica. La formazione spontanea di nanostrutture stabili, ottenute dalla combinazione della proteina con la molecola fotoattiva, è stata verificata sperimentalmente tramite tecniche spettroscopiche. E’ stato inoltre dimostrato che l’associazione di queste molecole con il sistema di trasporto proteico porta ad un miglioramento delle proprietà foto-fisiche interessanti della molecola in condizioni fisiologiche, principalmente a causa della ridotta aggregazione idrofobica. Il comportamento delle nanostrutture ottenute è stato quindi studiato in presenza di cellule batteriche o tumorali in sospensione, come semplice modello di un sistema biologico. Tali studi sono particolarmente importanti nel caso dell’utilizzo di fotosensibilizzatori come molecole fotoattive. Quando vengono foto-eccitate, queste molecole reagiscono con l’ossigeno molecolare presente in soluzione generando specie citotossiche dette specie reattive dell’ossigeno, tramite una reazione detta fotosensibilizzazione. Tale reazione viene spesso sfruttata dal punto di vista applicativo per eliminare microbi patogeni o cellule tumorali. L’efficacia dell’inattivazione cellulare dovuta al fotosensibilizzatore veicolato con la struttura proteica è stata valutata in relazione ai parametri fotofisici ed utilizzando immagini acquisite con tecniche di microscopia a fluorescenza. Inoltre, il miglioramento delle proprietà di emissione di fluorescenza da parte del fotosensibilizzatore Ipericina legato alla struttura proteica, è stato sfruttato per ottenere immagini di microscopia a fluorescenza aventi risoluzione al di sotto del limite della diffrazione, acquisite tramite la tecnica di microscopia STED (Stimulated Emission Depletion). Alcuni chiari vantaggi negli effetti della foto-inattivazione cellulare, derivanti dall’utilizzo di sistemi di trasporto proteici, sono stati individuati per confronto con il fotosensibilizzatore libero. Alcuni complessi metallorganici fotoattivi, appartenenti alla categoria dei triplet emitters, sono stati studiati per il loro enorme potenziale come sonde fluorescenti utilizzabili per tecniche di imaging su bio-sistemi. Il principale problema riguardo l’uso di questi composti in condizioni biologiche è costituito dalla instabilità delle proprietà spettroscopiche, dovuta principalmente alla aggregazione per effetto idrofobico. E’ stato possibile dimostrare che la combinazione con un sistema proteico permette di superare il problema della stabilità e porta alla formazione di un sistema stabile, solubile in soluzioni acquose, poco invasivo e pertanto adatto per l’applicazione come sonda luminescente in bio-sistemi.