Structural and molecular determinants affecting the interaction of retinol with human CRBPs

Abstract

Four intracellular retinol-binding protein (CRBP) isoforms, belonging to the intracellular lipid-binding protein (iLBPs) family, have been reported in human. Despite their low sequence identity, they show a high structural conservation. CRBP 1 and 2, for which retinol is the endogenous ligand, bind retinol with high affinity, while CRBP3 and 4 show for it a low and very low affinity, respectively. The absorption spectra of the retinol bound to CRBP1, 2 and 3 shows a peak with a maximum at approximately 348 nm and two shoulders, while the same assay on CRBP4 shows a different spectrum with a maximum at about 330 nm. One of the most obvious differences between the four isoforms is a substitution in one of the two binding key residues: the glutamine 108, present in CRBP1 and 2, is replaced with a histidine residue in CRBP3 and 4. In this work we have studied the role of the key binding residues by the characterization of three CRBP1 mutants: K40L, Q108L and the K40L/Q108L double mutant, demonstrating that the substitution of both the key residues preserves the ligand up-take and that hydrophobic interactions between hydrophobic residues of the cavity and the lipophilic part of retinol are sufficient to hold the ligand inside the pocket. Therefore, other factors, distinct from the substitution of one of the binding residues, are responsible for the differences in the behavior of CRBPs. In addition, our data suggest the presence of a cation π-interaction between the side chain of Lys40 and the retinol poly-isoprene tail. The different flexibility of the four isoforms could be an important feature to clarify CRBP differences. To this aim, we have performed MD simulations on the apo-proteins, observing a higher rigidity of CRBP1 and 2 compared to the flexibility of CRBP3 and 4. Different regions belonging to distinct isoforms are interested by different mobility. The ligand up-take mechanism of iLBPs is a broadly debated topic and for CRBPs is not yet understood. We have carried out MD simulations on the four isoforms in the presence of retinol and we have proposed two different up-take models for the binding mechanism of CRBP1 and 2. The ligand up-take simulations on CRBP3 and 4 have suggested the possibility that these two isoforms could bind compounds different from retinol. Finally, we have studied the interaction of CRBP1, 3 and 4 with a new natural retinoid fortuitously identified during a protein purification passage.

Nell’uomo sono state identificate quattro isoforme di intracellular retinol-binding protein (CRBP), appartenenti alla famiglia delle intracellular lipid binding protein (iLBP). Nonostante la loro bassa identità di sequenza, esse mostrano un’elevata conservazione strutturale. Le CRBP1 e 2 legano il retinolo, loro ligando endogeno, con alta affinità, mentre le CRBP3 e 4 mostrano rispettivamente una bassa e molto bassa affinità per esso. Gli spettri di assorbimento del retinolo legato alle isoforme CRBP1, 2 e 3 mostrano un picco con un massimo di assorbimento a circa 348 nm, e due spalle laterali; la CRBP4 mostra uno spettro differente, con un massimo di assorbimento a 330 nm. Una delle differenze più evidenti tra le quattro isoforme è la sostituzione di uno dei due residui chiave per il binding: la glutammina in posizione 108, presente nelle CRBP1 e 2, è sostituita con un residuo di istidina nelle CRBP3 e 4. In questo lavoro di ricerca abbiamo studiato il ruolo dei due residui chiave nel legame del retinolo, sfruttando la caratterizzazione di tre mutanti della CRBP1: K40L, Q108L e il doppio mutante K40L/Q108L, dimostrando che la sostituzione di entrambi i residui chiave preserva l’up-take del retinolo e che le interazioni idrofobiche tra i residui della cavità e la parte lipofila dl retinolo sono sufficienti a trattenere il ligando nella tasca di legame. Inoltre, altri fattori differenti dalla sostituzione di uno dei due residui chiave, possono essere responsabili del diverso comportamento delle CRBP. I nostri dati suggeriscono, poi, la presenza di un’interazione catione π tra la catena laterale della Lys40 e la catena poli isoprenica del retinolo. La diversa flessibilità delle quattro isoforme potrebbe essere una caratteristica importante, utile a chiarire tali differenze. A questo scopo, abbiamo effettuato simulazioni di dinamica molecolare sulle quattro proteine nella forma apo, osservando una rigidità maggiore delle CRBP1 e 2 rispetto all’elevata flessibilità delle CRBP3 e 4. Differenti regioni appartenenti alle diverse isoforme sono interessate da una differente flessibilità. Il meccanismo di up-take del ligando è una problematica diffusamente studiata per tutte le iLBP e non ancora chiarita, in particolare per le CRBP. Abbiamo eseguito simulazioni di MD sulle quattro isoforme in presenza del retinolo, proponendo due diversi modelli di up-take per le CRBP1 e 2. Le stesse simulazioni eseguite selle CRBP3 e 4 hanno suggerito la possibilità che queste due isoforme possano legare composti diversi dal retinolo. Infine, abbiamo studiato l’interazione delle CRBP1,3 e 4 con un nuovo retinoide naturale, fortuitamente identificato durante la purificazione proteica.