Expression study of XTP1 and SDP35 RhoGAPs in high-grade soft tissue sarcomas: correlation with prognosis

Abstract

Scopo I sarcomi delle parti molli (SPM) sono tumori rari che presentano istogenesi incerta e difficoltà nell’effettuare una corretta diagnosi. A oggi non esistono marcatori in grado di predire la loro aggressività ed evoluzione clinica. I pazienti metastatici affetti da SPM hanno prognosi sfavorevole e vi è la necessita di individuare nuovi biomarcatori da utilizzare anche per la pianificazione di nuovi protocolli terapeutici. A tale fine, in questo studio retrospettivo condotto su una serie di tessuti tumorali di SPM ad alto grado di malignità si è correlata l' espressione dell’oncogene MET, target del microRNA miR-152, precedentemente trovato sotto-espresso in SPM, della proteina IGFBP7 che appartiene al pathway del fattore di crescita IGF, e di due molecole di trasduzione del segnale appartenenti alla famiglia RhoGAP, SDP35/DEPDC1A e XTP1/DEPDC1B, con il decorso clinico della malattia in termini di progressione metastatica. Metodi e risultati L’analisi di RT-PCR ha confermato la sotto-espressione di miR-152 in 59 tumori primitivi di SPM rispetto ai controlli sani, mentre l’analisi immunoistochimica su una ampia casistica di 131 campioni tumorali mostrava uniforme e forte espressione della proteina target MET. Tale over-espressione era particolarmente evidente in pazienti che svilupparono metastasi durante il follow-up. L’induzione di espressione di miR-152 in cellule di leiomiosarcoma (SKLMS-1) riduceva l'espressione di MET, associata a riduzione di crescita cellulare e ad aumento di cellule apoptotiche, confermando cosi il ruolo di MET come target di miR-152. Anche la proteina 7 che lega il fattore di crescita IGF, IGFBP7, e la RhoGAP SDP35/DEPDC1A erano più espresse nei pazienti metastatici rispetto ai non metastatici consolidando il loro ruolo prognostico. In particolare, l'immunocolorazione ha mostrato una variazione nell’ intensità e nella distribuzione delle due RhoGAPs : XTP1/DEPDC1B aveva una distribuzione citoplasmatica mentre SDP35/DEPDC1A una localizzazione prevalentemente nucleare. L’espressione di SDP35/DEPDC1A e XTP1/DEPDC1B è stata studiata anche a livello trascrizionale in 86 SPM primitivi, 22 metastasi polmonari e 17 tessuti adiacenti sani . Questi ultimi presentavano minima o assente espressione dei trascritti mentre i tessuti neoplastici avevano alti livelli di mRNA che erano significativamente più elevati nelle metastasi rispetto ai tumori primitivi. Inoltre, l’analisi statistica ha rivelato che i pazienti con alti livelli di trascritti nelle lesioni primitive avevano una maggiore probabilità di sviluppare metastasi, suggerendo che tale up-regolazione sia correlata con la progressione tumorale. Dall’analisi multivariata è emerso che l’overespressione genica di SDP35/DEPDC1A, l’età superiore ai 60 anni e assenza di radioterapia post-operatoria sono fattori indipendenti di rischio metastatico. Studi preliminari in vitro ~ 6 ~ mostrarono che linee cellulari e culture primarie di STS mantenevano un’alta espressione di RhoGAP mentre il silenziamento di SDP35/DEPDC1A riduceva sia la proliferazione che la migrazione suggerendo un suo coinvolgimento nel controllo della dinamica del citoscheletro e dei cambiamenti morfologici importanti per le funzioni cellulari. Conclusioni I nostri dati su una serie di SPM confermano il ruolo prognostico di MET e IGFBP7 e indicano SDP35/DEPDC1A come marcatore prognostico indipendente correlato ad un alto rischio di metastasi. Quest’ultimo dato è supportato da studi preliminari su cellule isolate da STS che suggeriscono che l'aumentata espressione di SDP35/DEPDC1A e XTP1/DEPDC1B e il loro transito nucleo-citoplasma possono contribuire ad un fenotipo più aggressivo promuovendo cambiamenti nella morfologia cellulare associati alla proliferazione e movimento delle cellule tumorali.

Aim Soft tissue sarcomas (STS) are rare tumours with uncertain histogenesis, difficulties in establishing correct diagnosis and no, or very few reliable prognostic markers. Similarly, biological factors that predict their aggressiveness and clinical evolution remain largely undefined. Prognosis of metastatic STS patients is strongly unfavourable and in need of new therapeutic strategies. To overcome some of these limitations, we investigated the expression patterns of two poorly studied unique signal transduction molecules belonging to the RhoGAP family, previously discovered to be misexpressed in STS. We also studied the relative expression levels of miR-152, previously found altered in STS, known to control MET expression, another vital factor in sarcomatogenesis. Methods and Results By RT-PCR, miR-152 resulted down-regulated in 59 primary STS samples compared to healthy controls. miR-152 transfection in SKLMS-1 cells led to reduced expression of its target, the oncogene MET, transient decrease in cell growth and increased apoptosis. Immunohistochemistry revealed that MET, along with the growth factor IGFBP7 were more expressed in metastatic than in metastasis-free STS patients. We then evaluated SDP35/DEPDC1A and XTP1/DEPDC1B transcriptional levels in 86 primary STS and in 22 paired lung metastasis by RT qPCR. We detected a poor-to-absent transcript expression in 17 tumour surgical margin tissue samples used as healthy controls. In contrast, STS specimens had abundant levels of both mRNAs which increased in metastases compared to paired primary tumours. Immunohistochemistry revealed that both RhoGAPs varied in intensity and distribution. XTP1/DEPDC1B was diffusely distributed in the cytoplasm, whereas SDP35/DEPDC1A displayed a predominant nuclear, and occasionally cytoplasmic, localization suggesting that it may undergo cytoplasmic-nuclear shuttling. In metastatic samples both proteins appeared more expressed than in paired primary lesions with a predominant nuclear localization. By immunoblotting a stronger SDP35/DEPDC1A expression was seen in metastatic lesions compared to primary tumours. Correlation analyses stressed that patients with more abundant XTP1/DEPDC1B and SDP35/DEPDC1A transcripts in primary lesions had a higher probability of incurring in metastatic disease, suggesting that RhoGAPs up-regulation was related to an increased metastatic capability. By multivariate analyses, over-abundance of SDP35/DEPDC1A transcript, age over 60 years and no post-surgery radiation therapy were strong independent risk factors. In a panel of STS cell lines and proprietary STS cells isolated from metastatic lesions both XTP1/DEPDC1B and SDP35/DEPDC1A were up-regulated in highly ~ 4 ~ replicating cells and correlated with rounding morphology. To study the precise role of RhoGAPs in the control of STS cell behaviour a RNAi-based knocked-down approach was adopted. These experiments indicated that abrogation of SDP35/DEPDC1A expression affected both cell proliferation and migration, suggesting that RhoGAP could be involved in the control of cytoskeletal dynamics and in cell shape changes needed in fundamental cellular events. Conclusions Our data suggest that the observed MET overexpression may be associated with miR-152 down-regulation, causing a decrease in cell proliferation. Increased expression of MET and other biomarkers putatively involved in STS progression seem to significantly impact upon clinical behaviour. Notably, altered expression of RhoGAPs SDP35/DEPDC1A and XPT1/DEPDC1B strongly correlated with progression to a metastatic condition and these observations identified SDP35/DEPDC1A as a novel biomarker of poor prognosis. Preliminary studies on isolated STS cells suggest that increased SDP35/DEPDC1A and XPT1/DEPDC1B expression and their cytoplasmic-nuclear shuttling, may contribute to a more aggressive phenotype by promoting cell shape changes associated with cancer cell proliferation and movement.